괴사 유도 중 두 가지 주요 신호 전달 이벤트인 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 강력한 시각화는 기술적으로 어려운 일이었습니다. 제시된 티라마이드 증폭 프로토콜은 이 두 분자의 민감한 검출을 가능하게 합니다. 신호 증폭 단계는 검출 임계값을 낮추어 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 강력하고 재현성 있는 검출을 가능하게 합니다.
90, 000 ZBP1 발현 HT-29 세포를 1cm 정사각형 표면적 웰 플레이트의 전체 강도 McCoy's 5A 배지에 파종하여 고급 현미경 검사를 허용합니다. 웰당 200마이크로리터의 최종 부피를 사용하십시오. 세포를 섭씨 37도에서 5%이산화탄소와 함께 밤새 배양합니다.
세포가 70 내지 80%컨플루언시에 도달하면, 5개의 감염 다중성에서 림 돌연변이 ICP6을 암호화하는 단순 포진 바이러스 1을 함유하는 200 마이크로리터 예열된 완전 강도 McCoy's 5A 배지에서 세포를 감염시킨다. 괴사증을 유도하기 위해 9 시간 동안 바이러스와 함께 세포를 배양하십시오. 괴사 유도에 대한 양성 대조군으로서, 예열 된 괴사 유발 칵테일 200 마이크로 리터로 4 시간 동안 세포를 자극하십시오.
음성 대조군으로 섭씨 37도에서 예열된 10마이크로몰 GSK840 22마이크로리터를 추가하여 RIPK3 키나아제 활성을 억제합니다. 이 억제제를 치료되지 않은 상태에서 그리고 괴사증 자극 후에 포함시켜 세린 227의 자가인산화를 방지한다. 세포를 고정시키기 위해, 배지를 제거하고 200 마이크로리터의 PBS로 세포를 세척한다.
그런 다음 PBS를 제거하고 실온에서 평형 화 된 150 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드를 첨가하십시오. 세포를 실온에서 30분 동안 배양한다. 고정 후 4% 파라포름알데히드를 제거하고 200마이크로리터의 PBS로 세포를 3회 세척합니다.
샘플은 추가 처리가 있을 때까지 밤새 섭씨 4도에서 PBS를 초과하여 보관할 수 있습니다. 플레이트로부터 PBS를 제거하고, 세포를 100 마이크로리터의 투과 완충액과 함께 실온에서 30분 동안 틸팅 실험실 진탕기에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 투과화 완충액을 제거하고, 세포를 100 마이크로리터의 세척 완충액으로 세척한다.
이미징 챔버를 세척 완충액과 함께 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5분 동안 배양합니다. 1차 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 플레이트를 실온에서 100 마이크로리터의 블로킹 배지와 함께 틸팅 실험실 진탕기에서 2시간 동안 배양한다. 다음으로, 틸팅 실험실 쉐이커에서 실온에서 5 분간 배양하면서 100 마이크로 리터의 세척 완충액으로 웰을 3 회 세척한다.
세척 완충액을 제거한 후, 100 마이크로리터의 1차 항체를 이미징 챔버에 첨가한다. 티라미드 신호 증폭의 잠재적 배경을 시각화하고 마스킹 역치를 설정하기 위해 1차 항체가 없는 조건을 포함하는지 확인하십시오. 챔버를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
1차 항체 믹스를 제거하고, 웰을 100 마이크로리터의 세척 완충액으로 3회 세척하고 틸팅 실험실 진탕기에서 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 세척 완충액을 제거한 후, 세포를 100 마이크로리터의 HRP-표지된 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 증폭될 1차 항체의 종을 인식하여 틸팅 실험실 진탕기에서 30분 동안 배양한다. 항체 인큐베이션 동안, 비오티닐화된 티라미드 믹스를 준비한다.
HRP의 효소 활성을 유발하려면 사용하기 전에 TSA 버퍼에 산화 기질을 새로 추가하십시오. 그런 다음 최적화된 희석액을 사용하여 준비된 TSA 완충액에 비오티닐화된 티라미드를 희석합니다. HRP-표지된 2차 항체로 배양한 후, 틸팅 실험실 진탕기에서 5분간 배양하면서 세척 완충액으로 웰을 3회 세척한다.
웰로부터 세척 완충액을 제거한 후, 희석된 비오틴-티라미드를 100 마이크로리터의 최종 부피가 되도록 웰에 첨가한다. 반응물을 틸팅 실험실 진탕기에서 10분 동안 실온에서 인큐베이션한 다음, 3회의 세척 완충액 세척을 한다. 2차 항체, 결합된 스트렙타비딘, 및 핵염색 및 세척 완충액을 포함하는 염색 혼합물을 준비한다.
세척 완충액을 제거하고, 플레이트를 실온에서 100 마이크로리터의 염색 혼합물과 함께 틸팅 실험실 진탕기에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 이 단계부터 이미징 챔버를 빛으로부터 차폐하십시오. 염색 후, 세척 완충액으로 2회 연속적으로 세척하고, PBS로 웰을 2회 헹구었다.
이미징까지 염색을 보존하기 위해 섭씨 4도에서 PBS를 초과하는 샘플을 보관하십시오. 이제 이미징 챔버를 컨포칼 현미경으로 시각화할 준비가 되었습니다. 티라마이드 신호 증폭을 포함함으로써 림 돌연변이 ICP6 감염 세포를 코딩하는 단순 포진 바이러스의 세포질에서 세린 227에서 인산화된 RIPK3의 강력한 검출이 가능해졌습니다.
2%의 레이저 출력은 민감한 감지에 충분했습니다. 표준 간접 면역 형광법에서, 더 높은 레이저 출력은 phospho-RIPK3의 검출에 불충분했다. 3차원 Z-스택 이미지의 정량화에서, 감염된 세포는 모의 처리된 세포에 비해 인산화된 RIPK3에 대해 양성인 복셀의 약 20배 증가를 보였다.
모의-처리된 세포에 비해 야생형 단순 포진 바이러스 1 감염된 세포의 증가된 phospho-RIPK3 염색은 ICP6의 림 도메인이 세린 227에서 RIPK3 인산화를 완전히 차단할 수 없음을 나타내었다. GSK840은 RIPK3의 키나아제 도메인에 결합하고, ZBP1 활성화 시 세린 227에서 RIPK3 인산화를 방지하여 티라마이드 신호 증폭 매개 포스포-RIPK3 검출 방법의 특이성을 확인하였다. 모의 처리된 세포는 세린 358에서 MLKL 인산화의 약간 단첨된 세포질 염색에서 낮은 것으로 나타났고, 감염된 세포의 세포질, 핵 및 원형질막에서 강한 염색이 검출되었습니다.
표준 간접 면역 형광법은 감염된 세포에서 phospho-MLKL 신호의 특이적 검출을 위해 40%레이저 출력이 필요했습니다. 대조적으로, 티라마이드 신호 증폭은 phospho-MLKL의 검출 감도를 증가시켜 필요한 레이저 출력을 6%로 낮춥니다. 3D Z 스택 이미지 정량화는 티라마이드 신호 증폭을 사용하여 phospho-MLKL에 양성인 복셀 수가 약 90배 증가한 것으로 나타났으며, 표준 방법을 사용한 것과 비교하여 phospho-MLKL에 대한 검출 임계값 및 감도가 향상되었음을 나타냅니다. 단순 포진 바이러스와 유사하게 인플루엔자 A 바이러스 감염은 ZBP1 의존성 괴사를 유발했습니다.
티라마이드 신호 증폭은 괴사를 나타내는 포스포-RIPK3 및 포스포-MLKL의 강력한 검출을 가능하게 했습니다. 컨포칼 염색을 해석하려면 여러 염색 제어를 포함해야 합니다. 이것은 일차 조건, 단일 얼룩 및 양성 대조군을 수반하지 않습니다.
이 프로토콜을 적용하면 순차적 TSA를 사용하여 여러 표적을 증폭할 수 있습니다. 이것은 동일한 세포 내에서 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 검출을 가능하게 할 것이다. 괴사증 바이오마커의 민감한 검출은 실행된 ZBP1 의존성 세포 사멸 경로가 여전히 괴사, 세포자멸사 또는 열병으로 확인되어야 하는 자가염증 또는 바이러스 감염에 대한 진행 중인 ZBP1 연구에 통찰력이 있을 수 있습니다.
