이 절차의 전반적인 목표는, 신장 조직에서 염증및 세포 사를 분석하는 성인 얼룩말 물고기에 있는 신증후군에이전트로 cisplatin의 사용을 설명합니다. 이 것을 달성하기 위해 성인 얼룩말 물고기는 심연및 복막 구멍에 cisplatin의 특정 복용량에 주입하는 무게. 사망률을 모니터링한 후, 신장은 해부되고 세포는 유동 세포측정을 위해 분리되거나 형광TUNEL 분석에 의해 분석될 수 있도록 고정 및 해부된다.
다음 절차는 급성 신장 손상 모델과 성인 얼룩말 물고기를 개발하는 도구로 시스플라틴의 신독성 효과를 사용하여 신장 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 모델은 신장 보호에 있는 새로운 치료 표적의 탐구를 위해 이용될 수 있을 뿐만 아니라 얼룩말 물고기 신장에 있는 재생의 기계장치를 해명할 수 있습니다. Cisplatin는 다양한 암을 치료하는 데 사용되는 화학 요법 제제입니다.
그러나 신장에 쉽게 축적되어 세포 사멸, 염증을 일으키고 신장 기능을 감소시킬 수 있습니다. cisplatin의 효과 복용량 의존, 그래서 당신은 당신의 목표에 따라 투약의 우리의 증가를 낮출 수 있습니다. 염증과 세포 사멸을 분석하기 위해 여기에서 사용되는 기술은 질병 모델의 보급을 위한 것이 아닙니다.
얼룩말 물고기의 흐름 세포질은 동물의 염증 상태를 정량적으로 해명하는 데 도움이 될 수 있으며, TUNEL에서는 생리학적 및 병리학적 맥락에서 팝토 세포의 존재를 명확히 할 수 있다고 말합니다. 실험을 시작하기 전에, 0.9%의 염화나트륨에 밀리당 820 마이크로그램으로 스톡 솔루션을 희석하여 시스플라틴 작업 용액을 준비한다. 다음으로, 다른 얼룩말 물고기를 마취하고 일부 종이 타월에 물을 과도하게 건조시.
무게를 기록, 규모에 배치하여 물고기를 무게. 주입할 정확한 볼륨을 알 수 있도록 계산을 합니다. 체중 1그램당 120 마이크로그램의 복용량을 얻으려면 다음 수식을 사용하십시오.
작업 용액의 복용량에 의해 최종 복용량을 분할 하 고 마이크로 리터에이 숫자를 변환, 에 대 한 곱하 여 1000 cisplatin의 볼륨을 얻을 수. 그런 다음, 이 숫자를 물고기의 무게에 곱하여 최종 부피를 주입합니다. 젖은 스폰지에 물고기를 놓고, 작은 컵을 들고.
복부 측을 위로 하고 cisplatin의 계산된 부피로 인슐린 주사기를 채웁니다. 복부 중진선에 바늘을 얕은 각도로 삽입하고 복부 벽을 부드럽게 당겨 내부 장기에 구멍을 뚫지 않도록하십시오. 그런 다음 용액을 주입합니다.
주사 후, 마취에서 회복하기 위해 탱크에 물고기를 배치하고 수영과 적절한 움직임과 같은 회복의 징후를 기다립니다. 다음 날 하루에 두 번 물고기를 모니터링하십시오. 이 복용량에서, cisplatin 주위 유도 30% 처음에 사망률의 24 시간.
물고기를 안락사시키고 종이 타월에 물을 과도하게 건조시다. 머리와 내부 장기를 제거 한 후 해부 바늘을 사용하여 신체 벽을 고정하십시오. 물고기의 등쪽 벽에 있는 신장을 찾아내고, 신장을 분리하기 위하여 집게를 이용합니다.
신장을 1X PBS 1X, 2%FBS의 시원한 용액으로 6개의 웰 플레이트에 놓고 얼음을 유지합니다. 다음으로, 액체로 조직을 집어 들고 40 미콘 세포 스트레이너를 통과하고 주사기 플런저로 조직을 부드럽게 선별합니다. 1X PBS 1회, 2%FBS로 두 번 세척하세요.
그리고 50 밀 팔콘 튜브에서 세포를 수집합니다. 그런 다음 400 G.신중에서 5 분 동안 원심 분리기를 파이펫으로 상체를 픽업하고 폐기하십시오. 감기 1X PBS 500마이크로리터를 추가하여 세포를 다시 중단하고 5밀 흐름 세포측정관에 배치합니다.
얼음 위에 보관하십시오. 샘플 의 10 마이크로 리터를 가지고 에펜도르프 튜브에 트라이판 블루의 90 마이크로 리터와 혼합. 네오바우어 챔버에 혼합물 10마이크로리터를 넣고 현미경으로 세포를 계산합니다.
세포계를 읽은 다음 관심사의 인구를 선택하는 결과를 분석합니다. 이 절차를 위해, 물고기를 안락사하 고 신체에 연결 된 신장을 떠나 내부 장기를 제거. 그런 다음 바디 벽을 코르크 표면에 고정하고 고정 용액을 통해 아래로 페이징합니다.
하룻밤 사이에 4도 유지하십시오. 다음 날, 정밀 한 강제로 신장을 해부. 그것을 방해하지 않으려고.
작은 페트리 접시 나 1X PBS가있는 엡펜도르프 튜브에 놓아 헹구십시오. PBS를 변경하고 2%아가로즈를 준비하여 신장에 대한 지지 매트릭스를 생성하여 단단히 처리합니다. 남은 PBS를 모두 버리고 아가로즈를 천천히 붓습니다.
그런 다음, 신장을 미세한 집게로 배치하여 접지 않도록 합니다. 실온에서 아가로즈가 고화시키도록 하십시오. 아가로즈 고형화 후 메스를 사용하여 작은 큐브를 형성하는 신장 주위의 아가로즈를 자른다.
아가로즈 큐브를 조직학적 카세트 안에 넣고 조직학적 처리를 위해 파라핀에 조직을 포함시게 한다. 파라핀 블록, 우리는 다음 다섯 미크론 두께 섹션으로 잘라 것입니다. 드 왁스 슬라이드와 증류수에 보관하십시오.
어두운 인큐베이터 챔버를 준비하여 젖은 종이 타월을 바닥에 놓습니다. 어두운 챔버에 슬라이드를 놓고 조직의 투과화를 위해 Proteinase K를 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하세요.
시료가 배양되는 동안, 라벨 용액 450 마이크로리터에 50 마이크로리터의 효소 용액을 추가하여 TUNEL 반응 혼합물을 준비합니다. 그리고 빛으로부터 보호하십시오. 어두운 챔버를 들고 1X PBS로 슬라이스를 두 번 씻으세요.
다음으로 슬라이드와 TUNEL 반응 혼합물을 건조시십시오. 그리고 2 시간 동안 섭씨 37섭씨도에서 배양하십시오. 인큐베이션 후 1X PBS로 슬라이드를 다시 세척합니다.
그리고 핵 카운터 염색을 위한 DAPI를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 1X PBS 1개를 사용하면 세 번 헹구습니다.
그리고, 안티 페이드 친수성 매체로 슬라이드를 성형. 커버 슬립을 놓습니다. 그리고 매니큐어로 밀봉.
형광 현미경으로 샘플을 시각화합니다. 이 그래프에서, cisplatin는 0.9%의 염화나트륨으로만 주입된 대조군과 비교하여 어류 생존에 대한 용량 반응 효과가 있음을 알 수 있습니다. 이 그래프의 빨간색 선은 이 비디오에서 사용되는 그램당 120 마이크로그램의 용량을 나타냅니다.
이러한 복용량은 남성과 여성에 적용 될 수 있습니다., 통계 차이 그들 사이 발견 되었다. 유동 세포측정은 조직에 존재하는 다른 세포를 정량화할 수 있습니다. 조혈 세포 인구는 크기 또는 앞으로 산란 및 세분성 또는 크기 산란에 의해 여러 물고기의 신장에서 확인됩니다.
이렇게 하면 적혈구, 림프구, 과립구 및 조혈 전구체로 인구를 분리할 수 있습니다. 여기서, 현재의 게이트 전략은 과립구, 단하나 및 MPO 양성 세포를 선택하여 골수페로시다제의 형광 발현에 의해 표시된 신장내호중구의 인구를 찾을 수 있게 한다. 이 경우, 시스플라틴의 주사는 신장에 존재하는 호중구의 비율의 증가를 유도.
TUNEL 분석은 형광 현미경에 의해 신장의 조직 슬라이드를 관찰하여 조직에서 세포 세포를 검출할 수 있도록 허용하며, 일부 세포의 핵 내부의 세포 세포 내부의 세포 멸망 신호를 볼 수 있습니다. 파란색으로 여기 이러한 DAPI에서 핵 얼룩에 의해 대조. 시스플라틴 주사는 신장에 있는 세포 세포의 존재를 증가시켰으며, 이는 수동으로 또는 이미지 소프트웨어를 사용하여 정량화할 수 있다.
이 비디오의 끝에서 당신은 주입 하 고 성인 얼룩말 물고기에 급성 신장 부상을 유도 하는 cisplatin의 복용량을 조정 하는 방법을 알 수 있어야. 그리고 다른 목적을 위해 신장을 해부하는 방법. 흐름 세포측정은 실험실에서 트라그랩클 라인의 가용성에 따라 다른 세포 유형의 프로필을 이해하는 데 도움이되는 훌륭한 도구입니다.
모든 세포 유형에 레이블을 지정하기 위해 항체를 사용하려는 경우 운송선의 색상을 고려해야 합니다. TUNEL 분석법은 우리가 세포 세포와 조직을 검출할 수 있는 간단한 공구이고, 현미경 검사법에서뿐만 아니라 유동 세포측정에 의해서분석될 수 있습니다. 전체 시술 중에 항상 개인 보호 장비를 사용하십시오.
