우리는 프로토콜의 개발에 대 한 Helty Adisetiyo, 박사 Shangxin 양 박사를 감사 하 고 싶습니다. 전반적인 지원에 대 한는 국제 모성 소아 청소년 에이즈 임상 실험 그룹 (IMPAACT) 국립 연구소의 알레르기와 감염 증 (NIAID)의 국립 보건원의 건강 (NIH) 보너스 번호 아래에서 제공한 UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC)와 UM1AI106716 (IMPAACT 액정), 아동 건강과 인간 발달 (NICHD)의 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소와 국립 연구소의 정신 건강 (NIMH)에서 공동 자금. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 NIH의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

모든 프로토콜 단계에 대 한 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 해야 합니다, 그리고 엄격한 오염 예방 방법을 수행 해야 합니다. 샘플의 오염을 최소화 하기 위해 후 증폭 작업 영역에 영역을 작동 하는 사전 증폭에서 작품의 흐름을 관찰 합니다. 사용 하는 모든 공급은 살 균, RNase, DNase, DNA, pyrogen의 무료 이다. 모든 피 펫 팁 필터링 됩니다. 프로토콜 단계의 순서도 (그림 1)를 제공 됩니다.
1. 샘플 세포
참고: 샘플 세포 및 핵 산 추출 클린 룸 환경에서 DNA/RNA 추출 키트를 사용 하 여 엔지니어링 및 절차적 컨트롤 샘플에 환경 박테리아의 도입을 최소화 하에서는 수행 됩니다.
<ol><li>
작업 영역 준비
	<ol>
<li>깨끗 한 biosafety 내각 (BSC) 핵 산 오염을 제거 하기 위해 적절 한 표면 청소기 영역을 작동 합니다.</li>
		<li>온도 제어 vortexer, 설정 하 고 37 ° c.에 설정</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Guanidinium 안산 세포의 용 해 버퍼를 준비 (재료의 표 참조)
	<ol>
<li>침전 물에 대 한 세포의 용 해 버퍼를 확인 합니다. 37 ° c.에서 온난 하 여 다시 분해 침전</li>
		<li>각 샘플에 대 한 6 µ L β-mercaptoethanol (β-ME)와 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L를 준비 합니다. 샘플 당 추가 20% 볼륨을 고려 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 준비
	<ol>
<li>전체 우유, 냉동 얼음에 녹여. Aliquot 5 mL 전체 15 mL 또는 BSC에 5 mL 무 균 튜브에 우유 하 고 얼음에 그것을 유지.</li>
		<li>작은 셀을 4 ° C에서 5000 x g에서 10 분 동안 aliquot 5 mL 우유를 회전 합니다.</li>
		<li>지방 층을 제거, 튜브, 플라스틱 주걱 또는 큰에 상위 계층 피 펫 팁을 지루하게 하는 지금.</li>
		<li>방해 없이 펠 릿, 100 µ L 제외한 모든 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>워시 1 mL의 멸 균 인산 염에 resuspending에 의해 펠 릿 버퍼링 식 염 수 (PBS).</li>
		<li>5 mL 튜브를 무 균 PBS의 1 mL을 추가 하 여 1 부정적인 제어를 준비 합니다.</li>
		<li>원심 분리기 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 정지를 전송 하 고 1 분 (실 온 (RT)에서 5000 x g)에 대 한 microcentrifuge에 스핀.</li>
		<li>1000 µ L 살 균 필터링 된 피 펫 팁을 사용 하 여 전체 상쾌한/지방산 레이어 삭제.</li>
		<li>같은 날, 스냅인를 추출 하지 고정 셀 에탄올/드라이 아이스 슬러리에 넣어 작은 하 고 즉시-80 ° C 냉동 고로 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 중단 및 균질 (구슬-구타)
	<ol>
<li>Β-ME는 펠 릿을 포함 하는 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L을 추가 하 고 비드 튜브에 정지를 전송.</li>
		<li>12의 각 추출 배치 10 샘플, 1 부정적인 제어 (위의 단계 3.7에서에서 준비), 그리고 1 긍정적인 제어 (다음 단계에서 준비)에 포함 되어 있습니다.<ol>
<li>세포의 용 해 버퍼와 20 µ L 세균성 모의 샘플 (사용 모의 공동체는, 한 번 추출의 농도 DNA의 약 0.2 ng / µ L)의 1 긍정적인 제어를 준비 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>와 동 모든 15에 대 한 적극적으로 튜브 비드 s.</li>
		<li>700-800 rpm에서 떨고와 10 분 동안 37 ° C에서 온도 제어 vortexer에 열 샘플.</li>
		<li>자동화 샘플 방해 어댑터 집합으로 튜브를 로드 합니다.</li>
		<li>구슬 30 Hz에서 1 분이 겼 다.</li>
		<li>어댑터 세트를 분해 하 고 악기의 오른쪽 로봇 팔을 왼쪽된 로봇 팔에서 샘플 접시 세트 어댑터를 수동으로 전환.</li>
		<li>구슬 30 Hz에서 다른 1 분이 겼 다.</li>
		<li>25 ° c.에 3 분 동안 17200 x g에서 원심 분리기 튜브</li>
		<li>200 µ L 피 펫, 샘플 또는 상단에 지방 층의 샘플의 하단에 잔여 고 균질 화기 열에 적용 하지 않도록 주의 되 고와 함께 상쾌한의 모든을 제거 합니다.</li>
		<li>최대 속도, 25 ° c.에 3 분 동안 17200 x g에서 원심 분리기 균질 화기 열</li>
		<li>(다른 튜브를 사용 하지 마십시오) DNA와 RNA의 정화에 대 한 자동화 된 악기와 함께 사용 하기 위해 2 mL 제조업체의 microcentrifuge 튜브에 eluate의 350 µ L를 전송. 조심 하지 어떤 잔여 지방 층을 전송 합니다.</li>
		<li>흐름을 통해 볼륨 보다 350 µ L 이면 350 µ L의 최종 볼륨을 β-ME와 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.</li>
		<li>샘플 실시간 진행 하기 전에 최대 2 h에 대 한 자동화 된 DNA 정화 악기를 사용 하 여 핵 산 격리를 두거나-80 ° c.에 고정</li>
	</ol>
</li>
	<li>
작업 영역을 청소
	<ol>
<li>깨끗 한 모든 표면에 비-효소 오염 제거 솔루션을 사용, 10 분 동안 다음 70% 에탄올 스프레이 두고 닦아 표면.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA/RNA 분리
<ol><li>
작업 영역 준비
	<ol>
<li>열 블록 설정 하 고 설정 온도 70 ° c</li>
		<li>온도 제어 vortexer 설정 하 고 설정 온도 37 ° c</li>
		<li>워밍업-10 mM Tris-Cl, pH 8.5, 70 ° c 50 mL 튜브에 들어 있는 차입 버퍼 (EB)</li>
		<li>워밍업-350 µ L까지 완전히 37 ° C에서 2 mL 튜브에 냉동된 샘플 lysates의 어떤 침전 (약 10 분) 없이 해 동.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA 정화
	<ol>
<li>소용돌이 원심 분리기 2 mL 튜브 샘플 짧게 (3000 x g 10 s).</li>
		<li>다음 자동된 DNA/RNA 정화 악기의 로드 차트 제조 업체의 지시 당 셰이 커에 2 mL 튜브를 삽입 합니다.</li>
		<li>로 터 어댑터를 얻을 하 고 샘플의 수에 따라 용지함에 그들을 설정 합니다.</li>
		<li>각로 터 어댑터 샘플의 식별 (ID)에 따라 분류.</li>
		<li>뚜껑을 잘라내어 DNA와 RNA에 대 한 개별 스핀 열 가장자리를 매끄럽게.</li>
		<li>로 터 어댑터에 컬렉션 튜브 없이 DNA 스핀 열을 삽입 합니다. 컬렉션 튜브를 삭제 합니다.</li>
		<li>라벨 1.5 mL 컬렉션 튜브, 고로 터 어댑터에 삽입 합니다.</li>
		<li>다음 자동된 DNA/RNA 정화 악기의 로드 차트 원심 분리기에로 터 어댑터를 설정 합니다.</li>
		<li>제조업체의 1000 µ L 필터-팁 팁 랙에 삽입 합니다.</li>
		<li>(특정 컴퓨터 프로토콜 명령) 당 샘플 수에 따라 2 mL 제조업체의 microcentrifuge 튜브에 RNase 무료 물을 추가 합니다.</li>
		<li>Microcentrifuge 튜브 슬롯의 튜브 슬롯 "A"에 튜브를 삽입 합니다.</li>
		<li>시 약 병에 10 mL의 최소 볼륨으로 채우기 남은 모든 시 약을 삭제 합니다.</li>
		<li>시 약 병 랙 (EB 병)을 제외 하 고 시 약 병을 삽입 합니다.</li>
		<li>시 약 병 위치 6에 50 mL 튜브에서 따뜻한 EB를 추가 합니다.</li>
		<li>1.5 mL 튜브로 터 어댑터에 단단히 배치 됩니다 확인 하십시오.</li>
		<li>악기의 뚜껑을 닫고 선택: "RNA" → "추출 키트" → "동물, 조직 및 세포" → "키트의 이름 350 µ L 부분 A 사용자 정의 DNA" → 편집 차입 볼륨 100 µ L (기본값) 또는 낮은 바이오 매스 샘플 → 50 µ L을 "시작."</li>
		<li>완료 되 면 회전자는 원심 분리기에서 어댑터를 제거 하 고 용지함에 넣어.</li>
		<li>로 터 어댑터 위치 3에서에서 DNA 스핀 열을 삭제 합니다.</li>
		<li>로 터 어댑터 삭제 하지 마십시오, RNA는 위치 2에.</li>
		<li>3의 위치에 eluted DNA를 포함 하는 1.5 mL 컬렉션 튜브를 제거 하 고 −20 ° C에 저장</li>
		<li>모든 샘플은 남아, 그렇지 않으면 삭제 하는 경우 뿌리와 −20 ° C가 게에서 포함 하는 샘플 튜브를 수집 합니다.</li>
		<li>"키트의 이름 350 µ L 부분 B RNA" 추가 RNA의 정화에 대 한 프로토콜을 계속.</li>
		<li>RNA 정화는 약 350 µ L 자형 회전자 어댑터의 중간 위치에에서 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA 정화
	<ol>
<li>로 터 어댑터에 컬렉션 튜브와 뚜껑 없이 RNA 스핀 열을 삽입 합니다.</li>
		<li>새로운 1.5 mL 컬렉션 튜브 라벨을 설명서에 표시 된 대로 터 어댑터에 그들을 삽입 합니다.</li>
		<li>다음 자동된 DNA/RNA 정화 악기의 로드 차트 원심 분리기에로 터 어댑터를 설정 합니다.</li>
		<li>악기의 뚜껑을 닫고 선택: "RNA" → "제조업체의 키트" → "동물, 조직 및 세포" → "표준 부품 B RNA" → "시작."</li>
		<li>완료 되 면, 회전자는 원심 분리기에서 어댑터를 제거 하 고 용지함에 넣어.</li>
		<li>위치 3에서에서 RNA 스핀 열을 삭제 합니다.</li>
		<li>위치 3에서 30 µ L eluted RNA를 포함 하는 1.5 mL 컬렉션 튜브를 제거 하 고 −80 ° C에 저장</li>
		<li>시 약 병을 제거 합니다.</li>
		<li>유해 폐기물을 적절 한 채널을 통해 회전자 어댑터 내용을 삭제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
깨끗 한 작업 역
	<ol>
<li>모든 자동화 된 DNA/RNA 정화 악기의 액세서리, 시 약 선반, 쟁반, 및 다른 표면에 같은 비-효소 오염 제거 솔루션을 사용, 10 분 동안 두고 린스 스프레이 (디) 저온 다음 그들이 말리 면.</li>
		<li>스프레이 자동된 악기 제조업체에 비-효소 오염 솔루션 승인, 사용 중인 모든 표면 함께 원심 분리기의 내부를 닦아, 10 분, 두고 70% 에탄올으로 닦아. 그들은 악기를 손상 시킬 수 있습니다 오염 솔루션의 다른 종류를 사용 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 타겟된 16S PCR 설치
참고: 16 PCR에 대 한 설정 클린 룸 내에 있는 지정 된 사전 증폭 작업 영역에서 수행 됩니다. 시 약 및 샘플은 준비 하 고 3 (30 샘플, 3 중, 96의 총에 진정한 샘플 및 추출 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 플러스 2 PCR 물 컨트롤을 포함 하는 중에 각 샘플에 대 한 PCR을 수행 하는 액체 처리기에 로드 결합 된 샘플 및 컨트롤)입니다. PCR 반응 조립 및 봉인, 일단 샘플 접시 사이클링 후 증폭 지역에 위치한 열 cycler에 전송 됩니다.
<ol><li>
작업 영역 준비
	<ol>
<li>PCR 워크스테이션을 청소. 스프레이 RNase, DNase, DNA와 함께 사용에서 모든 표면 decontaminant, 뒤 디 물에 두 번, 그리고 마지막으로 70% 에탄올.</li>
		<li>16S PCR 워크시트 준비 (타겟 16S PCR 워크시트 참조) 정확한 샘플 목록 및 각 샘플9할당 다른 바코드 뇌관. 인쇄 워크시트 및 플레이트 지도 (접시 1 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR 마스터 믹스 준비 참고: 16 뇌관 선택 특정 연구에 대 한 관심 영역에 따라 그리고 연구 또는 샘플 형식에 의해 변경 될 수 있습니다. 따라서, 주문 하기 전에 프라이 머, 그것은 특정 연구에 대 한 관심의 미생물을 증폭 하는 최고의 16S rRNA의 어떤 영역을 확인 하는 것이 중요. 로 작성 된이 프로토콜 16 V4 영역의 확대입니다. 다른 프라이 머/지역을 선택한 경우 열 사이클링에 어 닐 링 온도 조정을 해야 합니다.<ol>
<li>모든 것을 준비 하는 PCR 워크스테이션에서 작동 합니다.</li>
		<li>-20 ° C에서 DNA 샘플의 50-100 µ L 및 필요한 모든 시 약을 꺼내와 얼음에 녹여. 소용돌이 짧게 스핀 다운.</li>
		<li>뇌관은 미리 20 µ L의 최소 볼륨에서 5 µ M의 작업 농도에 희석 됩니다.</li>
		<li>워크시트에서 계산에 따르면 앞으로 뇌관만 특정 5 mL 튜브에 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
로봇을 이용한 액체 처리기 자동화 된 PCR 설치 준비
	<ol>
<li>샘플에 대 한 32-그럼 악기의 샘플 어댑터를 꺼내 하 고 제조업체의 지침에 따라 96 잘 접시 지도 따라 DNA 샘플의 50-100 µ L를 로드 합니다.<ol>
<li>각 PCR 접시, 깨끗 한 샘플 튜브에 물이 PCR의 30 µ L를 배치 하 여 2 부정적인 컨트롤을 설정 합니다.</li>
			<li>모든 샘플 32 잘 악기의 샘플 어댑터에 뚜껑 열린 위치에서 잠금 넣습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>반전 뇌관9<ol>
<li>특정 바코드와 각 역 뇌관의 모자를 제거 # ' 1 번 (교차 오염을 방지 하는 사이 변화 장갑)에.</li>
			<li>악기의 시 약 어댑터에 최대 32 뇌관을 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>96-잘 PCR 접시 밖으로가 고 연구 이름, 시료 번호, 날짜, 및 기술자의 이니셜 라벨.</li>
		<li>로봇을 이용한 액체 처리기 로드<ol>
<li>위치 지 하 1 층에에서 시 어댑터를 넣습니다. 가장자리 효과 방지 하기 위해 신중 하 게 그립 쪽에 대 한 어댑터의 한쪽 가장자리 놓고 천천히 다른 가장자리를 내리게 합니다. 어댑터의 모든 모서리를 눌러 있는지 확인 하십시오.</li>
			<li>위치 c 1에서 샘플 어댑터를 놓습니다. 어댑터의 모든 모서리를 눌러 있는지 확인 하십시오.</li>
			<li>소용돌이 5 mL 마스터 믹스, 뚜껑을 열고 하 고 악기의 마스터 믹스 및 시 약 블록에 위치 A에 그것을 배치.</li>
			<li>반 치마를 입은 PCR 접시를 위한 96-잘 악기의 어댑터에 PCR 접시를 놓습니다.</li>
			<li>실행을 시작 하 고 새 파일로 저장 합니다.</li>
			<li>나타나는 메시지에 따라 그리고 각 프롬프트를 표시 하는 확인: 1, 팁을 사용할 수 있습니다, 2, 폐기물 상자는 사용할 수, 그리고 3, 시작.</li>
		</ol>
</li>
		<li>실행 완료 되 면 확인 오류 메시지에 대 한 컴퓨터를 검사 하 여 오류가 있었습니다.</li>
		<li>적극적으로, 12 또는 8 스트립 모자, 소용돌이와 접시를 봉인 하 고 96 잘 접시 회전자를 사용 하 여 1 분 동안 스핀 다운 얼음 이나 냉장고에 그것을 배치.</li>
		<li>반전 뇌관 및 샘플 튜브를 제거 합니다.</li>
		<li>후 증폭 방에 96 잘 접시를 받아 고 열 순환 조건 ( 표 1참조)의 표에 따라 주기 고 열 cycler에 접시를 로드 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 타겟된 16S 포스트 PCR 품질 관리 젤 전기 이동 법을 위한 테이프 기반 플랫폼을 사용 하 여
참고: 포스트 PCR 품질 관리 (QC) 및 모든 후속 단계는 실시 실험실의 지정 된 후 증폭 지역에서. DNA는 자동화 된 DNA/RNA 조각 분석기에서 분석 된다.
<ol><li>
작업 영역 준비
	<ol>
<li>살포 사용 RNase, DNase, DNA에에서 모든 표면 decontaminant, 뒤 디 물에 두 번, 그리고 마지막으로 70% 에탄올으로 워크스테이션을 청소.</li>
		<li>모든 공급 및 필요한 장비를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시 약 준비
	<ol>
<li>최소 30 분의 25 ° C에서 온도 제어 vortexer에서 샘플 버퍼와 사다리를 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시 약은 워밍업 하는 동안 단일 관으로 각 샘플에 대 한 3 PCR 복제를 풀링 하 여 PCR 샘플 준비</li>
	<li>악기에는 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>짧게 소용돌이 고 풀링된 PCR 제품 튜브 아래로 회전.</li>
	<li>RT에서 선반에 악기의 96 잘 접시를 놓고 그것을 분류 합니다.</li>
	<li>짧게 소용돌이 스핀 다운 샘플 버퍼 및 사다리.</li>
	<li>96 잘 접시 (필요 이상 53 µ L/화면 테이프)의 각 음에 3 µ L 견본 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>샘플;는 짝수 실행 샘플 수가 홀수인 경우는 빈 우물에 샘플 버퍼의 4 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>사다리를 사다리의 1 µ L를 잘 추가 합니다.</li>
	<li>그것의 지정 풀링된 PCR 제품의 1 µ L를 추가 하는 다음 지도, 잘.</li>
	<li>커버 호 일 씰 플레이트</li>
	<li>소용돌이 1 분 2000 rpm에서 악기의 vortexer와 어댑터를 사용 하는 접시.</li>
	<li>다시 경우 튜브의 하단에 샘플 아래로 회전 급강하 거품 위치까지 회전 합니다.</li>
	<li>소프트웨어를 시작 합니다.</li>
	<li>에 스크린 테이프와 로드 팁을 로드 합니다.</li>
	<li>96-잘 어댑터와 조각 분석기에 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>컨트롤러 소프트웨어와 함께 실행을 설정 합니다.</li>
	<li>심지어 번호 우물을 선택 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>샘플 Id를 작성 합니다.</li>
	<li>확인 화면 테이프의 모든 우물 회색으로 강조 표시 됩니다.</li>
	<li>분석기는 모든 피 펫 팁을 인식 하는지 확인 합니다.</li>
	<li>시작을 선택 하 고 (샘플 번호, 이름과 날짜 연구) 결과를 저장할 파일 이름을 지정 합니다.</li>
	<li>자세한 내용은 제조업체의 설명서를 참조 하십시오.</li>
	<li>실행 완료 되 면, 팁, 화면 테이프, 및 튜브를 삭제 합니다.</li>
	<li>16S 피크 nM (v4 315-450 bp) 사이 대 한 데이터를 분석 합니다. 이 피크는 뇌관 선택에 따라 달라 집니다.</li>
</ol>5. 라이브러리 계산, 풀링, 정리 및 품질 관리
<ol><li>결정 후 amplicon 크기와 모든 샘플의 몰, 수영장 최종 원하는 볼륨 및 nM 풀링된 라이브러리 라이브러리 (샘플 계산 참조).</li>
	<li>정리 및 집중 실리 카 멤브레인 기반 정화를 사용 하 여 풀링된 라이브러리 PCR 제품, 제조 업체의에 따르면 키트 ( 재료의 표참조) 프로토콜 합니다.<ol>
<li>50 µ L의 최종 볼륨 DNA elute</li>
	</ol>
</li>
	<li>Double을 사용 하 여 즉시 청소 라이브러리의 농도 측정 제조 업체의 프로토콜에 따라 DNA 높은 감도 fluorometer 킷 좌초.<ol>
<li>198 µ L 희석 버퍼 플러스 염료 (1: 100 희석)의 함께 풀링된 및 청소 라이브러리의 2 µ L를 희석.</li>
		<li>Fluorometric 장치에서 측정 된 값을 기록 하 고 희석 비율에 따라 변환.</li>
	</ol>
</li>
	<li>농도 (ng / µ L) 풀링된 라이브러리에 대 한 읽기를 사용 하 여 라이브러리 몰 nM에서 계산 합니다. 1 µ L undiluted 라이브러리를 사용 하 여 측정 하는 microvolume 분 광 광도 계에 OD260/280. 참고: 값이 1.8-2.0 라이브러리의 적절 한 순도 나타냅니다.</li>
	<li>다음 세대 시퀀싱에 대 한 준비까지-20 ° C에서 최종 라이브러리를 저장 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li>
<li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Holobiont%3A+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li>
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<li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564(2014).</li>
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<li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19(2015).</li>
<li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li>
<li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73(2016).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

16S rRNA의 타겟된 다음-세대 시퀀싱 미생물 특성화18에 대 한 널리 사용 되 고, 급속 한 기술입니다. 그러나, 일괄 처리 효과, 환경 오염, 샘플 교차 오염을, 감도, 재현성 등 많은 요인 수 부정적인 실험 결과 영향을 하 고 그들의 해석7,19 혼동 , 20. 가장 강력한 16S 분석을 용이 하 게에 미생물 워크플로 좋은 실험 ...

인간 식민지 미생물 지역 사회는 인간의 건강과 신진 대사, 면역 발달, 질병 민감성과 예방 접종과 약물 치료1, 에 대 한 응답에 영향을 미치는 질병에 매우 중요 한 것으로 2. 현재 인간의 건강에는 microbiota의 영향을 이해 하는 노력 강조 뿐만 아니라 지역화 된 사이트 정의 해부학 구획 (즉, 피부, 창 자, 구두, 등), 관련 된 미생물의 식별 이러한 구획3,4. 이러한 조사 활동을 underpinning 급속 한 출현 및 샘플의 미생물 유전 콘텐츠 (미생물)의 분석에 대 한 대규모 병렬 플랫폼을 제공 하는 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 증가 접근성입니다. 많은 생리 샘플, 관련 된 미생물은 복잡 하 고 풍부한 (즉,의 자), 하지만, 일부 샘플은 미생물 어디 낮은 미생물 바이오 매스 (즉, 인간의 우유, 낮은 호흡기)로 표현 됩니다 감도, 실험적인 인공 물, 및 가능한 오염 될 주요 문제. 미생물 연구와 적절 한 실험적인 디자인의 공통 과제 여러 검토 기사5,6,,78의 대상이 되었습니다.
여기에 소개 강력한 NGS 실험 파이프라인 기반으로 rRNA 16S V4 지역9 인간 우유의 미생물 특성의 타겟된 시퀀싱 합니다. 인간 우유의 미생물 분석은 복잡 하지는 본질적으로 낮은 미생물 바이오 매스10여만 하지만 또한 높은 인간 DNA의 레벨11,12,,1314 배경 및 잠재적인 carryover PCR 억제제15,16 추출 된 핵 산의. 이 프로토콜은 상용 추출 키트와 샘플 준비 일괄 처리를 통해 변화를 최소화 하는 것을 도울 수 있는 반자동된 플랫폼에 의존 합니다. 그것은 프로토콜의 각 단계를 확인 하 고 파이프라인 견고성의 독립적인 통계를 제공 하는 품질 관리로 샘플 함께 처리 되는 잘 정의 된 세균성 모의 사회 통합. 로 프로토콜 인간의 우유 샘플에는 설명의 자, 직장, 질, 피부, 나, 그리고 구강 면봉10,17를 포함 하 여 다른 샘플 형식에 쉽게 적응할 수 이며 시작 지점으로 사용할 수 있습니다. 미생물 분석을 수행 하고자 연구원입니다.

<table><tbody><tr><td>AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>DNA/RNA extraction kit</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase, DNase, DNA decontaminant</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>temperature-controlled vortexer</td></tr><tr><td>Buffer RLT plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit</td></tr><tr><td>&amp;szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&amp;szlig;-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>bead tube</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>automated sample disruptor adapter set</td></tr><tr><td>QIAshredder column</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>QIAgen RB tube</td><td></td><td></td><td>manufacturer&#039;s microcentrifuge tube in kit</td></tr><tr><td>QIAcube and related plasticware</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>automated DNA/RNA purification instrument</td></tr><tr><td>DNA exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>non-enzymatic decontamination solution</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>elution buffer</td></tr><tr><td>QIAgility and related plasticware</td><td>Qiagen</td><td>9001532</td><td>robotic liquid handler</td></tr><tr><td>PCR water</td><td>MO BIO</td><td>17000-</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Barcoded reverse primers</td><td>Eurofin</td><td>No Catalog #&#039;s</td><td>designed and ordered</td></tr><tr><td>96 well PCR plate</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 and related plasticware</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>automated DNA/RNA fragment analyzer</td></tr><tr><td>D1000 reagents for Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Sample buffer and ladder are part of this kit</td></tr><tr><td>OneStep PCR Inhibitor Removal Kit</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>PCR inhibitor removal is done per the manufacturer&#039;s instructions.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>microvolume spectrophotometer</td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 kit</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catalog #&#039;s</td><td>next generation sequencer</td></tr></tbody></table>

a method for targeted 16s sequencing of human milk samples

미생물 커뮤니티 연구는 상대적으로 신속, 저렴 하 고 높은 처리량 시퀀싱의 개발을 광범위 하 게 되었다. 그러나, 이러한 모든 기술에서와 마찬가지로 재현 결과 실험실 워크플로 통합 하는 적절 한 예방 조치 및 컨트롤에 따라 다릅니다. 이것은 특히 낮은 바이오 매스 샘플 중요 어디 세균 DNA 오염 잘못 된 결과 생성할 수 있습니다. 이 문서 낮은-에 중순-throughput 규모에 16S ribosomal RNA (rRNA) V4 지역의 타겟된 시퀀싱을 사용 하 여 인간 유 방 우유 샘플에서 미생물을 식별 하는 반자동된 워크플로 자세히 설명 합니다. 프로토콜 설명 전체 우유 등에서 샘플 준비: 세포, 핵 산 추출, 증폭, 16S rRNA 유전자 및 품질 관리 조치 라이브러리 준비 V4 영역의 샘플. 프로토콜 및 토론 준비와 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, PCR 반응 억제제 제거, 샘플 오염 환경, 시 약, 포함 하는 낮은 바이오 매스 샘플의 분석을 돌출 하는 문제를 고려 하는 중요 한 것은, 또는 실험 소스, 고 재현성을 보장 하도록 설계 된 실험 모범 사례. 프로토콜을 설명 하는 대로 인간 우유 샘플, 면봉, 깔끔한, 또는 보존 버퍼에 안정 냉동에 수집 된 샘플을 포함 한 수많은 낮은 및 높은 바이오 매스 샘플 종류에 적응은.

여기에 제시 된 프로토콜 데이터 생성 충족 프로토콜 감도, 특이성, 및 오염 제어에 대 한 벤치 마크 되도록 중요 한 품질 관리 (QC) 조치를 포함 합니다. 프로토콜의 QC 첫걸음 16 v 4 지역 (그림 2)의 PCR 증폭을 다음과 같습니다. 각 샘플에서 PCR 제품의 1 개의 µ L 315-450 bp (그림 2, 빨간 화살표)의 예상된 크기 범위 내에서 그것은 확?...

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A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

반자동된 워크플로 인간 우유와 다른 낮은 바이오 매스 샘플 종류에서 16S rRNA의 타겟된 시퀀싱에 대 한 제공 됩니다.

인간의 우유 샘플의 타겟된 16S 시퀀싱 하는 방법

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.8K 조회수.  University of California at Los Angeles. 반자동된 워크플로 인간 우유와 다른 낮은 바이오 매스 샘플 종류에서 16S rRNA의 타겟된 시퀀싱에 대 한 제공 됩니다.

비디오: A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, optimization of their biotechnological synthesis is limited by the relatively low throughput of detection and quantification of monosaccharide and linkages. Conventional techniques of glycan analysis include chromatographic/mass-spectrometric methods with throughput on the order of hundreds of samples per day without automation. We demonstrate here, a genetically encoded bacterial biosensor for the high-throughput, linkage-specific detection and quantification of the fucosylated HMO structures, 2&#8217;-fucosyllactose and 3-fucosyllactose, which we achieved via heterologous expression of fucosidases. As the presence of lactose in milk or in biotechnological processes could lead to false positives, we also demonstrate the reduction of signal from lactose using different strategies. Due to the high throughput of this technique, many reaction conditions or bioreactor parameters could be assayed in parallel in a matter of hours, allowing for the optimization of HMO manufacturing.

We describe here the high-throughput detection and quantification of fucosylated human milk oligosaccharides (HMOs) using a whole-cell biosensor. We also demonstrate here, the adaptation of this platform towards analysis of HMO production strains, focusing on improving the signal to noise ratio.

Fucosylated 인간 우유 Trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

연구

생화학

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

면역학 및 감염병학

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

생물학

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

마우스의 장내 미생물에 대한 박테리오신 효과 평가 방법

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

음식과 환경 샘플에서 살 모 넬 라 의 준 metagenomic 분석

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

<meta charset="utf8"></head><body>모유를 이용한 저온살균 기증자 모유 미생물군 복원

Individualized Reconstitution of Human Milk Microbiota: A Feasible Approach in Real-World Settings

Mother&#39;s own milk (MOM) is the most complete nutritional resource for newborns. In cases where mothers are unable to produce sufficient milk or cannot breastfeed, the preferred alternative is pasteurized donor human milk (PDM), which is routinely provided by human milk banks. PDM offers a superior range of nutritional and immunological elements compared to any commercially available formula. However, to ensure biosafety, PDM undergoes pasteurization, a process that inactivates commensal microbiota and reduces certain bioactive compounds. This study presents a protocol designed to restore the microbiota of PDM using MOM as a microbial source, adapting the approach to a real-world clinical setting.
The protocol was implemented in a clinical trial conducted at a maternity hospital and its associated human milk bank, with the aim of providing personalized donor milk to preterm infants whose mothers cannot produce sufficient milk. The methodology involves inoculating PDM with 10% of MOM, followed by incubation at 37 &#176;C for 4 h. Microbiological analysis demonstrated successful bacterial growth in the inoculated milk (IM) post incubation, with the microbiota profile of the reconstituted milk (RM) closely resembling that of MOM, indicating effective microbiota restoration. These results suggest that the reconstitution protocol is feasible for implementation in neonatal care, with the potential to enhance the nutritional and immunological quality of PDM, thereby supporting the health and development of non-breastfed newborns.

<meta charset="utf8"></head><body>인간 모유 미생물총(Human Milk Microbiota)의 개별화된 재구성: 실제 환경에서 실현 가능한 접근 방식

The article describes a protocol for reconstituting pasteurized donor milk microbiota using the mother's own milk microbiota in practical, real-world settings. It demonstrates effective bacterial growth and microbiome modulation, supporting the feasible application of this procedure within the routine care of a maternity hospital and its associated human milk bank.

인간 모유 미생물총(Human Milk Microbiota)의 개별화된 재구성: 실제 환경에서 실현 가능한 접근 방식

Mother&#39;s own milk (MOM) is the most complete nutritional resource for newborns. In cases where mothers are unable to produce sufficient milk or cannot ...