이 방법은 생체 내 및 시험관에서 정상적인 호중구의 이동뿐만 아니라 마우스 관절염 모델에서 병리학 호중구의 침투를 평가하기위한 세 가지 자주 사용되는 방법을 설명하려고합니다. 우리는이 방법이이 분야의 다른 연구자를 위해 유용 할 수 있다고 생각합니다. 이 프로토콜은 공기 파우치 분석및 보조 유발 관절염을 사용하여 염증 부위의 호중구의 이동 능력을 평가하는 방법론적 세부 사항을 포함합니다.
이 기술의 의미는 치료 그룹과 모델 그룹을 비교하여 관절염 치료쪽으로 확장됩니다. 이 방법은 염증성 질환에 대한 통찰력을 제공 할 수 있으며 염증성 장 질환에 적용 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구소의 대학원 생인 칭이 루와 하이수 장(Haixu Jiang)이 될 것입니다.
0일째에 마우스의 마취 후, 5밀리리터 주사기에 부착된 0.22 미크론 필터를 사용하여 멸균 된 공기의 3 밀리리터 부피를 얻습니다. 핀셋으로 마취 된 마우스의 뒤쪽 피부를 들어 올리고 피하 3/8 인치 바늘로 26 게이지를 사용하여 멸균 된 공기의 3 밀리리터를 주입하십시오. 치료 후, 호흡 단위에서 마우스를 제거하고 잘 설정 된 케이지에 배치합니다.
마우스가 움직이기 시작할 때까지 살아 있는지 확인하기 위해 마우스를 모니터링합니다. 셋째 날에는 이전에 확립된 에어 포켓에 멸균 공기 3밀리리터를 추가로 주입하여 공기 파우치를 유지합니다. 6일째에는 공기 파우치에 다른 치료법을 주입합니다.
부정적인 대조군으로 PBS의 1 밀리 리터를 주입 하 고 로컬 염증을 유도 하는 긍정적인 제어로 밀리 리터 LPS 당 하나의 마이크로 그램의 1 밀리 리터를 주입. 6 시간 후, 마우스를 희생. 각 공기 파우치에 대해, 공기 파우치를 세척하고 15 밀리리터 원심분리기 튜브에서 염증 제비물을 수집하기 위해 세척 버퍼 1 밀리리터를 주입하십시오.
그런 다음 공기 파우치를 세척 버퍼 2밀리리터로 두 번 세척하고 동일한 원심분리기 튜브에서 염증 성 외출물을 수집합니다. 원심분리기는 실온에서 10분 동안 100배 g의 원심분리기. 상체를 버리고 세척 버퍼의 1 밀리리터로 셀을 다시 중단합니다.
자동 혈액학 분석기를 사용하여 호중구 비율을 정량화하기 위해 세포를 계산합니다. 적어도 5초 이상 소용돌이를 통해 완전한 Freund의 보조를 일시 중단한 다음 100마이크로리터의 서스펜션을 인슐린 인젝터로 그립니다. 마취 후, 선택한 발을 표시하고 발목 관절 공간에 네 개의 periarticular 반점에 인젝터에서 완전한 Freund의 보조제 20 마이크로 리터를 주입.
처리된 마우스를 새로운 챔버에 넣습니다. 마우스가 움직일 수 있는 능력을 회복할 때까지 호흡하고 있는지 확인하기 위해 마우스를 모니터링합니다. 3일마다 포켓 두께 게이지를 사용하여 발목 관절 직경을 측정합니다.
또한, 관절염 점수 기준에 의해 관절염 심각도 평가. 0은 정상입니다. 홍반과 붓기의 증거가 없습니다.
하나는 가장 가벼운 관절염입니다. 홍반과 온화한 붓기는 타르살 또는 발목 관절에 국한됩니다. 2개는 적당한 관절염입니다.
홍반과 가벼운 붓기는 발목에서 타르살로 확장됩니다. 세 가지는 심한 관절염입니다. 홍반과 중간 부종은 발목에서 중족골 관절까지 연장됩니다.
4개는 가장 가혹한 관절염입니다. 홍반과 심한 붓기는 발목, 발 및 숫자, 또는 사지의 앵킬로증을 포함합니다. 마우스를 희생한 후 핀셋과 가위로 뒷다리에서 피부와 근육의 일부를 제거합니다.
70%에탄올로 관절을 뿌리고 종이 타월을 사용하여 나머지 근육을 제거합니다. 실온에서 2일 동안 발목 관절을 4%의 파라포름알데히드로 고정합니다. 그런 다음 실온에서 1개월 동안 10%EDTA로 조인트를 탈칼시화하고 중간 주간을 변경합니다.
한 달 후, 조직을 약 60섭에 액체 파라핀의 특정 부피가 있는 표시된 금형에 배치하여 조직을 포함시십시오. 잠시 식히세요. 마이크로톤의 두께를 4마이크로미터로 설정하고 슬라이스를 잘라냅니다.
그런 다음 섹션을 확장하기 위해 짧은 시간 동안 섭씨 43도 수조에 섹션을 플로트합니다. 섹션을 슬라이드에 마운트하고 슬라이드를 2 시간 동안 섭씨 70도에서 오븐에 넣습니다. 향후 사용을 위해 슬라이드를 영하 20도에서 보존하십시오.
다음으로, 슬라이드를 랙에 놓고 원고에 따라 자일렌과 에탄올에 세척하여 실온에서 수분을 보충합니다. 마지막으로, 흐르는 수돗물로 3분간 씻으시다. 그런 다음 0.1 % 빠른 녹색 용액으로 5 분 동안 얼룩지게합니다.
1%아세트산으로 10초 간 헹구고 0.1%의 사프란 오 스테닝 용액을 20분 동안 염색합니다. 그 후, 원고에 따라 자일렌과 에탄올 세척 솔루션에 슬라이드를 담그십시오. 조직 섹션을 개체 단계에 마운트하고 현미경으로 조직을 관찰합니다.
호중구를 시각화하려면 먼저 78°C에서 2시간 동안 파라핀 섹션을 굽아 면역히스토케미컬 염색을 수행합니다. 슬라이드를 랙에 놓고 원고에 따라 자일렌, 에탄올, 물 및 PBS 세척을 수행하여 실온에서 수분을 보충합니다. 그런 다음 조직을 커버하기 위해 투과화 버퍼 한 방울을 추가합니다.
습도 조절 트레이에서 10분 동안 섭씨 37도의 구역을 배양합니다. 그 후, 3 분 동안 PBS에서 슬라이드를 헹구십시오. 조직을 직접 헹지 마십시오.
다음으로, 열 유도항원 에피토프 검색을 수행한다. 슬라이드를 랙에 정렬합니다. 검색 버퍼로 채워진 압력 보일러에 슬라이드를 담그십시오.
압력 보일러를 전자레인지에 넣고 전자레인지를 600와트로 설정하고 슬라이드를 10분 동안 가열합니다. 끓인 후, 보일러에 슬라이드를 유지하여 섭씨 90도까지 식힙니다. 슬라이드를 꺼내 PBS에서 3분 동안 3분간 헹구세요.
내인성 과산화효소 활동을 담금질하려면 15분 동안 실온에서 3%의 과산화수소에 미끄럼을 담그십시오. PBS에서 슬라이드를 3분 3회 헹구십시오. 소수성 펜으로 샘플 주위에 큰 원을 윤곽을 설명합니다.
샘플을 만지지 마십시오. 3%소 세럼 알부민의 50~100마이크로리터를 샘플에 추가하여 60분 동안 습도 조절 챔버에 샘플을 차단하고 배치합니다. 그런 다음 차단 솔루션을 제거합니다.
PBS 희석 1 차 항체의 50 마이크로 리터를 각 섹션에 신속하게 추가합니다. 밤새 섭씨 4도에서 습도 제어 트레이에 슬라이드를 배양. 둘째 날에는 트레이를 꺼내 실온에서 30분 동안 방치하십시오.
그런 다음 PBS에서 슬라이드를 3분 동안 3분간 헹구십시오. 조직에 PBS 희석 이차 항체의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 30분 동안 습도 조절 트레이에서 30분간 인큐베이션을 합니다.
그런 다음 PBS에서 슬라이드를 3분 동안 3분간 헹구십시오. 희석DAB 용액을 5분간 개발합니다. DAB의 과잉 반응으로 인한 어두운 색상의 개발을 피하십시오.
슬라이드를 증류수로 헹구십시오. 헤마톡슬린의 슬라이드를 10초 동안 카운터스테인하고 슬라이드를 수돗물로 5분간 헹구십시오. 산성 알코올 슈퍼 빠른 분화 용액을 3 초 동안 헹구고 수돗물로 10 분 동안 헹구습니다.
원고에 따라 실온에서 에탄올과 자일렌 세척에 슬라이드를 담그십시오. 장착 솔루션으로 커버슬립을 수정합니다. 현미경으로 조직을 관찰하십시오.
이 연구에서는, 공기 파우치 실험은 생체 내에서 LPS에 의해 자극된 호중구 모집을 조사하기 위하여 수행되었습니다. 공기 파우치 의 백혈구 서브 세트는 제어보다 훨씬 높았다. 대조군에 비해, 보조 유도 관절염 그룹은 발에 상당한 부종을 보였다.
발목 관절 직경이 증가하고 관절염 점수가 지속적으로 상승했습니다. 연골 손상은 류마티스 관절염의 대표적인 증후군입니다. CFA 챌린지는 다량의 백혈구 침투, 유의한 연골 침식 및 수축증을 유도했습니다.
임의의 발현 수준에서 MPO는 조인트 섹션에서 유의히 강화된 호중구 침투의 대표적인 마커이다. 공기가 피부에 주입되어 있는지 확인하지만 근육에 주입되지 는 않습니다. 또한 항p84를 이용한 발목 관절 조직 섹션의 면역조직화학적 염색에 의한 호중구 세포외 트랩의 형성을 조사할 수 있거나 이러한 방법은 염증성 장질환과 같은 다른 염증성 질환을 연구하는 데 사용될 수 있다.
