이 방법은 전립선암의 유전자 조작 마우스 모델의 시작과 생체 내 및 체외 분석을 통해 전립선암 메커니즘의 조사에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직 해부에서 세포 격리 및 배양에 이르기까지 전립선암 마우스 모델의 완전한 분석을 허용한다는 것입니다. 비뇨 생식기 시스템, 또는 UGS를 노출 한 후, 단단히 중간 무딘 집게와 오줌 방광을 잡고, 마우스 복부에서 전체 시스템을 들어 올립니다.
방광과 전립선 아래 가위 한 쌍을 밀어 척추에 모든 방법을 밀어 척수를 통해 절개를하고, 전체 UGS의 제거를 허용하기 위해 복강에 남아있는 연결을 잘라. UGS를 해부 현미경으로 PBS 2~6밀리리터가 함유한 6센티미터 페트리 접시로 옮는다. 그리고 미세 한 집게와 미세 절 가위를 사용하여 전립선 조직을 자르지 않고 조직 시스템의 등쪽 및 복부 측면에서 모든 지방을 조심스럽게 지웁습니다.
모든 지방이 제거되면 방광을 집게로 당기고 방광을 기지에서 소비합니다. 나머지 조직 복부 쪽을 위로 놓고 집게로 하나의 덕트 끝을 잡고, 가위로 혈관을 따라 그 기지에 혈관을 소비한다. 다른 쪽에 동일한 용기를 제거하고 정액 소포와 전립선 사이에 집게를 삽입하여 필요에 따라 인접한 결합 조직의 조각을 허용합니다.
그런 다음 요도의 기지에 정액 소포를 추적하고 혈관을 구멍을 뚫지 않고 제거하십시오. 두 소포가 모두 제거되면, 나비의 날개를 닮은 등쪽 엽이 보이면 조직 등쪽을 위로 놓습니다. 각 등쪽 엽을 집게로 잡고, 등쪽 엽을 수집하고 복부 측에 조직을 설정하는 가위로 베이스에 조직을 잘라.
측면 엽을 수집, 이는 작고 일반적으로 측면에 요도를 포장하고 같은 방식으로 전방, 복부, 및 등쪽 엽 사이에 쐐기된다. 측면 엽보다 큰 복부 엽을 수집하고 요도에 누워 있습니다. 그런 다음 요도를 자르고 버리고 전방 엽을 수확합니다.
3D 배양을 위한 전립선 조직을 처리하기 위해, 로브를 DMEM의 2~3밀리리터를 함유한 10센티미터 접시로 옮기고, 메스를 사용하여 전립선 튜블러를 가능한 한 섬세하고 고르게 다진다. 조직 단편을 멸균 조직 배양 후드로 옮기고 새로운 15 밀리리터 튜브에 조직 용액을 추가합니다. 튜브의 부피를 신선한 배지로 최대 9밀리리터까지 가져와 텐X 콜라게나제 스톡 용액 1밀리리터를 조직 혼합물에 추가합니다.
소용돌이 후, 세포 외 매트릭스를 저하시키기 위해 섭씨 37도에서 2 시간 동안 흔들어 튜브를 배양. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 조직을 수집하고 EDTA에서 따뜻한 05 %의 스트립의 두 밀리리터에 펠릿을 다시 중단. 세포 간 및 세포 간 유착을 용이하게하기 위해 섭씨 37도의 5 분 후, 모든 덩어리를 깰 조직을 세타게하는 넓은 보드 팁P1000 파이프 헤드를 사용합니다.
P200 파이프헤드 팁으로 해리를 반복합니다. 그런 다음 트립신을 완전한 매체의 3 밀리리터로 중화시합니다. 500단위의 DNASE1을 조직 슬러리에 넣고 18게이지 바늘이 장착된 5밀리리터 주사기를 통해 5~10회 용액을 통과한 다음 20게이지 바늘을 통해 5회 전달합니다.
더 이상 큰 조직 조각이 보이지 않는 경우 40 마이크로미터 필터를 통해 서스펜션을 50 밀리리터 원유형 튜브로 필터링하고 원심 분리로 세포를 수집합니다. 세포 도금 및 배양의 경우, 완전한 전립선 상피 세포 성장 배지의 0.5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 전립선 상피 세포 성장 중간 농도의 밀리리터 당 5배 10~5번째 세포로 세포를 암시한다. 세포를 지하 막 세포 외 매트릭스와 혼합하여 2~3부의 용액 비율로 혼합하고, 적절한 실험세포 배양 용기에서 세포 현탁액을 플레이트한다.
그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터에 30 분 동안 배치하십시오. 세포외 매트릭스가 고화되면, 전동된 완전한 전립선 상피 세포 성장 매체로 배양을 커버하여 지하 막 세포 외 매트릭스 플러그를 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 5~10일 간 돌려보내 2~3일마다 배지의 절반을 상쾌하게 한다.
구체를 수확하려면 지하 멤브레인 세포 외 매트릭스 젤 플러그를 방해하지 않고 배지를 조심스럽게 흡인하고 지하 막 세포 외 매트릭스의 100 마이크로 리터에 대한 Disbase 용액 1 밀리리터를 추가하십시오. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트 의 바닥을 따라 긁어 내어 플레이트 바닥에서 세포외 젤을 슈퍼나티로 들어 올리고 전체 용액을 한 번 파이프하여 플러그를 작은 조각으로 분해합니다. 지하 막 세포 외 매트릭스가 완전히 용해 될 때까지 세포 배양 인큐베이터에서 여분의 세포 매트릭스 조각을 1 ~ 2 시간 동안 배양합니다.
그런 다음 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 그리고 추가 다운스트림 조작을 위해 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 마우스 전립선은 정액 소포와 요도에 등대 및 통풍관에 있는 로브의 4쌍으로 이루어질 것입니다.
전립선 엽은 여러 선 프로파일로 구성되어 있으며, 각각 은밀상피 세포로 둘러싸인 루멘으로 구성됩니다. 엽의 모양, 세포의 조직 및 분비의 특성은 로브에서 로브까지 다양합니다. 고립 된 전립선 세포는 지하 막 세포 외 매트릭스 배양 후 4 일 일찍 오르가노이드로 성장하기 시작합니다.
다음 1~6일 동안 대부분의 세포는 부분또는 전체 루멘을 나타내는 구체의 일부와 함께 고체 구체로 자랍니다. 스페로이드는 또한 F-액틴 염색과 공동 국소화되는 세포 대 세포 접합부에서 강한 베타 카테닌 염색을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 미세 절 단계를 꼼꼼하게 따르는 것이 매우 중요합니다.
예를 들어, 전립선 엽을 요도에 부착하는 동안 분리하므로 요도에 대해 어느 엽이 있는지 알 수 있습니다. 해부 절차에 따라, 절연 된 엽은 RMA 시퀀싱, 서양 블로팅 또는 면역 스테인닝과 같은 다운스트림 분석에 사용될 수 있습니다. 1 차적인 3D 배양 기술은 형태학 및 행동 변경을 위한 spheroids를 가진 생활을 감시하고 동일에 있는 어떤 신생물 변경을 확인할 수 있기 때문에, 전립선 암 기계장치에 추가 통찰력을 얻을 수 있습니다.
요약하자면, 이러한 전립선 해부 및 배양 방법은 유전자 조작 된 마우스 모델을 사용하여 전립선암의 메커니즘을 조사하기위한 귀중한 정보를 제공하기 위해 다양한 다운스트림 응용 프로그램에 통합 될 수 있습니다.
