Diese Methode kann beim Start von gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs und der Untersuchung des Prostatakrebsmechanismus durch In-vivo- und In-vitro-Analysen helfen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine vollständige Analyse des Prostatakrebs-Mausmodells ermöglicht, von der Gewebesektion bis zur Zellisolierung und -kultivierung. Nach der Exposition des Urogenitalsystems, oder UGS, greifen Sie die Harnblase fest mit mittlerer stumpfer Zange und heben Sie das gesamte System aus dem Bauch der Maus.
Schieben Sie eine Schere unter die Blase und Prostata bis zur Wirbelsäule, um einen Schnitt durch das Rückenmark zu machen, und schneiden Sie alle verbleibenden Verbindungen zur Bauchhöhle durch, um die Entfernung der gesamten UGS zu ermöglichen. Übertragen Sie das UGS unter einem Seziermikroskop auf eine sechs Zentimeter lange Petrischale mit zwei bis sechs Millilitern PBS. Und verwenden Sie ein Paar feine Zangen und Mikrodissektionschere, um sorgfältig das gesamte Fett von den dorsalen und ventralen Seiten des Gewebesystems zu entfernen, ohne Prostatagewebe zu schnippeln.
Wenn das gesamte Fett entfernt wurde, ziehen Sie die Blase mit der Zange und verbrauchen die Blase an ihrer Basis. Legen Sie die verbleibende Gewebe-Ventralseite nach oben und halten Sie einen Kanal endet mit der Zange, folgen Sie dem Gefäß zu seiner Basis mit einer Schere und verbrauchen das Gefäß an seiner Basis. Entfernen Sie das gleiche Gefäß auf der anderen Seite und setzen Sie die Zange zwischen den Samenbläschen und der Prostata ein, um bei Bedarf das Schnipseln des angrenzenden Bindegewebes zu ermöglichen.
Dann verfolgen Sie die Samenbläschen zu ihrer Basis an der Harnröhre und entfernen Sie die Gefäße, ohne sie zu punktieren. Wenn beide Vesikel entfernt wurden, legen Sie das Gewebe dorsale Seite nach oben, so dass die rückenden Lappen, die einem Schmetterling Flügel ähneln sichtbar sind. Halten Sie jeden dorsalen Lappen mit Zange, schneiden Sie das Gewebe an seiner Basis mit einer Schere, um die dorsalen Lappen zu sammeln und drehen Sie das Gewebe auf die ventrale Seite.
Sammeln Sie die seitlichen Lappen, die klein sind und in der Regel die Harnröhre auf der Seite wickeln und sind zwischen den vorderen, ventralen und dorsalen Lappen in der gleichen Weise verkeilt. Sammeln Sie die ventralen Lappen, die größer als die seitlichen Lappen sind und liegen auf der Harnröhre ventral. Dann schneiden und entsorgen Sie die Harnröhre, um die vorderen Lappen zu ernten.
Um das Prostatagewebe für die 3D-Kultur zu verarbeiten, übertragen Sie die Lappen auf eine 10-Zentimeter-Schale mit zwei bis drei MilliliterDMEM und verwenden Sie ein Skalpell, um die Prostatatubuli so fein und gleichmäßig wie möglich zu zerkleinern. Übertragen Sie die Gewebefragmente auf eine sterile Gewebekulturhaube und fügen Sie die Gewebelösung zu einer neuen 15-Milliliter-Röhre hinzu. Bringen Sie das Volumen in die Röhre bis zu neun Milliliter mit frischem Medium, und fügen Sie dem Gewebegemisch einen Milliliter TenX Kollagennase-Stammlösung hinzu.
Nach dem Wirbeln, inkubieren Sie die Röhre mit Schütteln für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius, um die extrazelluläre Matrix zu verschlechtern. Am Ende der Inkubation das Gewebe durch Zentrifugation sammeln und das Pellet in zwei Millilitern warmer 05%Streifen in EDTA wieder aufhängen. Nach fünf Minuten von 37 Grad Celsius, um das Spalten der Zell-zu-Zelle und Zell-zu-Matrix-Verklebungen zu erleichtern, verwenden Sie einen P1000 Pipehead mit einer breiten Brettspitze, um das Gewebe acht- bis zehnmal zu triturat, um Klumpen aufzubrechen.
Wiederholen Sie die Dissoziation mit einer P200-Rohrkopfspitze. Dann neutralisieren Sie das Trypsin mit drei Millilitern komplettem Medium. Mischen Sie 500 Einheiten DNASE1 in die Gewebeschlämme und geben Sie die Lösung fünf- bis zehnmal durch eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 18-Spur-Nadel, gefolgt von fünfmal durch eine 20-Spur-Nadel.
Wenn keine großen Gewebestücke mehr sichtbar sind, filtern Sie die Suspension durch einen 40-Mikrometer-Filter in ein 50-Milliliter-Konustube und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Für die Zellbeschichtung und Kultur, re-suspendieren Sie das Pellet in 0,5 Milliliter des vollständigen Prostataepithelzellwachstums Medium, und zeigen Sie die Zellen auf eine fünf mal 10 bis die fünfte Zelle pro Milliliter Prostataepithel Zell Wachstum mittlere Konzentration. Mischen Sie die Zellen mit der extrazellulären Konverstheponierung der Kellermembran in einem Lösungsverhältnis von zwei bis drei Volumen und verfestigen Sie die Zellsuspension im entsprechenden experimentellen Zellkulturbehälter.
Legen Sie die Zellen dann 30 Minuten lang in einen Zellkultur-Inkubator. Wenn die extrazelluläre Matrix verfestigt ist, decken Sie die Kultur mit einem vorgewärmten vollständigen Prostataepithelzellwachstumsmedium ab, wobei darauf zu achten ist, dass die Kellermembran der extrazelluläre Matrixstecker nicht gestört wird. Dann kehren Sie die Zellen für fünf bis zehn Tage in den Zellkultur-Inkubator zurück und erfrischen Sie die Hälfte des Mediums alle zwei bis drei Tage.
Um Kugeln zu ernten, aspirieren Sie das Medium sorgfältig, ohne die Kellermembran extrazellulären Matrix-Gel-Stecker stören, und fügen Sie einen Milliliter Disbase-Lösung für 100 Mikroliter Kellermembran extrazelluläre Matrix. Mit einem Zellschaber, kratzen entlang der Unterseite der Platte, um die Kellermembran extrazelluläre Gele von der Unterseite der Platte in den Überstand zu heben, und rohren Die gesamte Lösung einmal, um den Stecker in kleinere Stücke aufzuteilen. Inkubieren Sie die zusätzlichen zellulären Matrixstücke im Zellkultur-Inkubator für ein bis zwei Stunden, bis sich die extrazelluläre Matrix der Kellermembran vollständig aufgelöst hat.
Dann die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr übertragen. Und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation für weitere nachgelagerte Manipulationen. Die Mausprostata besteht aus vier Paaren von Lappen, die dorsal und ventral zu den Samenbläschen und Harnröhren liegen.
Die Prostatalappen bestehen aus mehreren Drüsenprofilen, die jeweils aus einem Lumen bestehen, umgeben von sekretorischen Epithelzellen. Die Formen der Lappen, die Organisation der Zellen und die Art der Sekretion variieren von Lappen zu Lappen. Die isolierten Prostatazellen beginnen bereits vier Tage nach der extrazellulären Matrixkultur der Kellermembran zu Organoiden zu wachsen.
In den nächsten ein bis sechs Tagen wachsen die meisten Zellen zu festen Kugeln heran, wobei ein Bruchteil der Kugeln ein partielles oder vollständiges Lumen aufweist. Die Sphäroide zeigen auch eine starke Beta-Catenin-Färbung an den Zell-zu-Zell-Kreuzungen, die mit F-Actin-Färbung kolokalisieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, die Schritte der Mikrodissektion sorgfältig zu befolgen.
Zum Beispiel, isolieren Sie die Prostatalappen, während sie noch an der Harnröhre befestigt sind, so dass Sie wissen, welcher Lappen ist, je nachdem, wo sie in Bezug auf die Harnröhre sind. Nach dem Sezierverfahren können die isolierten Lappen für nachgelagerte Analysen wie RMA-Sequenzierung, Western Blotting oder Immunostaining verwendet werden. Die primäre 3D-Kulturtechnik ermöglicht es Ihnen, weitere Einblicke in den Prostatakrebs-Mechanismus zu gewinnen, da Sie das Leben mit Sphäroiden auf Morphologie- und Verhaltensänderungen überwachen und neoplastische Veränderungen in diesem identifizieren können.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Prostata-Sektions- und Kulturmethoden in verschiedene nachgelagerte Anwendungen integriert werden können, um wertvolle Informationen für die Untersuchung des Mechanismus von Prostatakrebs mit gentechnisch veränderten Mausmodellen bereitzustellen.
