Bu yöntem, prostat kanserinin genetiği değiştirilmiş fare modellerinin başlangıcında yardımcı olabilir ve in vivo ve in vitro analiz yoluyla prostat kanseri mekanizmasının araştırılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, doku diseksiyonundan hücre izolasyonuna ve kültüre kadar prostat kanseri fare modelinin tam bir analizini sağlamasıdır. Ürogenital sistemi veya UGS maruz kaldıktan sonra, sıkıca orta künt forseps ile idrar kesesi kavramak, ve fare karın tüm sistemi yukarı kaldırın.
Omurilik yoluyla bir kesi yapmak için mesane ve prostat altında makas bir çift slayt ve tüm UGS kaldırılmasına izin vermek için karın boşluğuna kalan bağlantıları keserek. UGS'yi, iki ila altı mililitre PBS içeren altı santimetrelik petri kabına, bir diseksiyon mikroskobu altında aktarın. Ve ince forseps ve mikrodissection makas bir çift kullanın dikkatle herhangi bir prostat dokusu snipping olmadan doku sisteminin hem dorsal ve ventral taraf tüm yağ temizlemek için.
Tüm yağ çıkarıldığında, forceps ile mesane çekin ve tabanında mesane çıkarmak. Kalan doku ventral tarafı yerleştirin ve bir kanal tutarak forceps ile biter, makas ile tabanına gemi takip ve tabanında gemi çıkarmak. Diğer tarafta aynı damarı çıkarın ve gerekli olarak herhangi bir bitişik bağ dokusunun snipping izin vermek için seminal veziküller ve prostat arasında forceps yerleştirin.
Daha sonra seminal vezikülleri üretradaki üslerine kadar takip edin ve damarları delmeden çıkarın. Her iki vezikül çıkarıldığında, bir kelebeğin kanatlarına benzeyen dorsal loblar görünür böylece doku dorsal tarafı yerleştirin. Forceps ile her dorsal lob tutarak, dorsal lobları toplamak ve ventral tarafına doku açmak için makas ile tabanında doku kesti.
Küçük ve genellikle yan üretra sarın ve aynı şekilde ön, ventral ve dorsal loblar arasında sıkışmış olan lateral loblar, toplamak. Lateral loblardan daha büyük olan ve üretra ventral rallisi üzerinde yatan ventral lobları toplayın. Sonra kesip ön lobları hasat üretra atın.
3D kültür için prostat dokusunu işlemek için, DMEM 2-3 mililitre içeren 10 santimetrelik bir çanak lobları transfer ve ince ve eşit olarak prostat tübülleri kıyma için bir neşter kullanın. Doku parçalarını steril doku kültürüne aktarın ve doku çözeltisini yeni 15 mililitrelik bir tüpe ekleyin. Taze orta ile dokuz mililitre ye kadar tüp hacmi getirin ve doku karışımı için TenX kollajenaz stok çözeltisi bir mililitre ekleyin.
Girdap sonra, ekstrasellüler matris düşürmek için 37 santigrat derece iki saat sallayarak tüp kuluçka. Kuluçka sonunda, santrifüj ile doku toplamak ve EDTA sıcak% 05 şeritler iki mililitre pelet yeniden askıya. Hücreden hücreye ve hücreden matris yapışıklıklarının ayrılmasını kolaylaştırmak için 37 santigrat derecelik beş dakika dan sonra, herhangi bir kümeleri ayırmak için dokuyu sekiz ila 10 kez triturate için geniş bir tahta ucu ile bir P1000 pipehead kullanın.
P200 pipehead ucu ile dissosiation tekrarlayın. Sonra tam orta üç mililitre ile tripsin nötralize. Doku bulamacının içine 500 ünite DNASE1'i karıştırın ve çözeltiyi 18 kalibrelik bir iğneyle donatılmış beş mililitrelik şırıngadan 5 ila 10 kez geçirin ve ardından 20 kalibrelik bir iğneyle beş kez geçirin.
Daha fazla büyük doku parçası görünmediğinde, süspansiyonu 40 mikrometrelik bir filtreden 50 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin ve hücreleri santrifüj le toplayın. Hücre kaplaması ve kültürü için, tam prostat epitel hücre büyüme ortamının 0,5 mililitre pelet yeniden askıya, ve beş kez hücreleri ima 10 prostat epitel hücre büyüme orta konsantrasyon mililitre başına beşinci hücrelere. Hücreleri 2-3 hacimlik çözelti oranıyla bazal membran ekstrasellüler matrisle karıştırın ve hücre süspansiyonunu uygun deneysel hücre kültür kabına koyun.
Sonra hücreleri 30 dakika boyunca bir hücre kültürü kuluçka yerleştirin. Hücre dışı matriks katılaşmış olduğunda, önceden ısıtılmış komple prostat epitel hücre büyüme ortamı ile kültür kapağı, bodrum membran ekstrasellüler matris fişi rahatsız değil dikkat. Daha sonra hücreleri 5-10 gün boyunca hücre kültürünü niçin kuvöze geri döndürün, her iki ila üç günde bir ortamın yarısını serinletin.
Küreleri hasat etmek için, orta dikkatle bodrum membran ekstrasellüler matris jel fiş rahatsız etmeden orta aspire, ve 100 mikrolitre bodrum membran ekstrasellüler matris için Disbase çözeltisi bir mililitre ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, üstnatant içine plakanın alt kısmından bodrum membran ekstrasellüler jelleri kaldırmak için plakanın alt boyunca kazıyın ve daha küçük parçalara fişi kırmak için bir kez tüm çözüm boru. Hücre kültürü kuluçka makinesindeki ekstra hücresel matris parçalarını, hücre dışı matriks tamamen eriyene kadar 1-2 saat kuluçkaya yatırın.
Sonra hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik bir tüp e aktarın. Ve daha aşağı manipülasyon için santrifüj ile hücreleri toplamak. Fare prostatı meni vezikülleri ve üretra için dorsally ve ventrally bulunan loblar dört çift oluşur.
Prostat lobları birden fazla bez profilleri oluşur, her bir lümen oluşan, salgı epitel hücreleri ile çevrili. Lobların şekilleri, hücrelerin organizasyonu ve salgının doğası lobdan loba değişir. İzole prostat hücreleri, hücre dışı bazal matris kültüründen dört gün sonra organoidler halinde büyümeye başlar.
Sonraki bir ila altı gün içinde, hücrelerin çoğu kısmi veya tam lümen sergileyen kürelerin bir kısmı ile katı küreler halinde büyür. Spheroidler ayrıca F-aktin boyama ile birlikte lokalize hücre-hücre kavşaklarında güçlü bir beta catenin boyama göstermektedir. Bu prosedürü çalışırken, mikrodiseksiyon adımlarını titizlikle takip etmek çok önemlidir.
Örneğin, prostat loblarını hala üretraya bağlıyken izole edin, böylece üretra ile ilgili olarak hangi lobun nerede olduğunu bilirsiniz. Diseksiyon işlemini takiben, izole loblar rma dizilemesi, Batı lekeleme veya immünboyama gibi downstream analizi için kullanılabilir. Birincil 3D kültür tekniği prostat kanseri mekanizması hakkında daha fazla bilgi edinmenizi sağlar, çünkü morfoloji ve davranış değişiklikleri için küresel yaşam izleyebilir ve aynı neoplastik değişiklikleri tanımlayabilirsiniz.
Özetle, bu prostat diseksiyonu ve kültür yöntemleri genetik olarak tasarlanmış fare modelleri kullanarak prostat kanseri mekanizmasını araştırmak için değerli bilgiler sağlamak için çeşitli downstream uygulamaları dahil edilebilir.
