이 프로토콜의 전반적인 목표는 발현 플랫폼 S, baculovirus 발현 벡터 시스템의 커버리지에서 생체 화학, 생물리및 구조 연구를 위한 단백질의 밀리그램 양을 얻기 위해 대규모 생산에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제의 다중 분면 선별이다. 알마 세이토바 박사는 다음 단계를 발표할 예정입니다. 기하급수적으로 성장하는 SF9 세포를 혈청 이없는 곤충 매체에서 밀당 0.4 백만의 최종 세포 밀도로 희석하고 멸균 시약 저장소에 부어 넣습니다.
24웰 플레이트의 각 웰에 희석된 SF9 세포의 0.5 mils를 시드하는 프로그래밍 가능한 다중 채널 파이펫을 사용합니다. 이 볼륨은 우물의 작동 표면의 커버리지를 보장하기에 충분합니다. 동시에, 그것은 형질 응고 효율을 가능하게 너무 많이 희석하지 않습니다.
플레이트의 우물을 세포로만 라벨로 지정하고, 감염의 잠재적 징후를 평가하기 위해 전감염 및 비트랜스감염 된 세포의 비교를 위한 대조군으로 사용하십시오. 세포가 세포 배양 판에 부착할 수 있도록 필요한 때까지 약 1시간 동안 플레이트를 27도에서 배양합니다. 잘 혼합된 형질전환 시약을 보충되지 않은 곤충 배지와 멸균 시약 저장소에 희석하고 10초 동안 부드럽게 섞습니다.
12채널 파이펫을 사용하여 희석된 트랜잭션 시약102마이크로리터를 멸균 96 MicroWell 플레이트로 전송합니다. 재조합 바미드 DNA의 마이크로리터 당 0.2 마이크로리터 10마이크로리터를 96웰 마이크로웰 플레이트의 해당 우물로 옮기고 부드럽게 흔들어 서 양면에서 플레이트를 두드리십시오. 복잡한 형성을 위해 15-20 분 동안 형체 혼합물을 배양합니다.
96과 24웰 플레이트 사이의 전송을 위해 설계된 조정 가능한 6채널 파이펫을 사용하여, 트랜스페션 플레이트의 해당 우물에서 세포 낙하 구슬에 경질 혼합물을 오버레이하고, 27도에서 4시간 동안 배양한다. 세포의 단층 위에 배분 믹스의 분포를 보장하기 위해, 부드럽게 배양 시간 동안 앞뒤로 여러 번 접시를 흔들어. 트랜스펙트 시간 후 4~5시간 후에 는 1.5밀의 혈청 없는 곤충 매체를 추가합니다.
열 불활성 태아 소 혈청과 1 % 항생제 및 항마이코틱의 10 % 최종으로 보충하십시오. 72~96시간 동안 27도 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 가능하면 하루에 한 번 부드럽게 전환 판을 흔들어 주세요.
72 시간에서 96 시간 후 트랜스 페트 시간에 전염 된 세포에서 분명 감염의 표시를 찾습니다. 형질 전환 후 4~5일 후에, 감염의 표시는 반전된 현미경의 밑에 대조군 세포와 비교하여 전염된 세포에서 분명해야 하고, 세포 배양 배지로 분비되는 초기 재조합 바쿨로바이러스는 수집할 준비가 되어 있어야 합니다. P1 바이러스의 수집을 동시에 허용하기 위해 프로그래밍 가능한 전자 멀티 채널을 사용하여 P1 바이러스의 150 마이크로 리터가있는 24 개의 잘 블록에서 서스펜션 세포의 감염에서 갓 시드 된 SF9 세포의 감염.
15 분 동안 집단 P1 바이러스 주식의 나머지 부분을 스핀 다운, AirPore 시트와 감염된 SF9 세포의 현탁액 문화와 24 잘 블록을 커버. 24웰 블록을 27도에서 72~96시간 동안 245°C에서 흔들어 보배합니다. 예정된 생산 시간 4일 전에, 기하급수적으로 성장하는 SF9 세포를 밀당 200만 개의 최종 세포 밀도에서 Erlenmeyer 유리로 분할하여 1%의 최종 항생제 및 항mycotic을 함유한 혈청 없는 곤충 매체의 배플로 치실을 흔들었다.
이 단계는 생산 배치에서 새로운 세포의 감염을 위해 상신체에서 감염된 곤충 세포 및 P2 바이러스의 현탁액 배양을 생성합니다. 해당 P2 바이러스를 추가하고 감염된 세포를 25도 의 낮은 온도에서 배양하여 세포 성장을 늦추고 1 인치 스트로크가있는 궤도 셰이커에서 165 RPM에서 흔들립니다. 예정된 생산 시간 4일 전에, 2.8리터 Fernbach 쉐이크 플라스크에서 곤충 혈청 프리 미디어에서 기하급수적으로 성장하는 SF9 세포의 2리터를 밀당 100만 개의 세포 밀도로 한다.
150 명의 RPm에서 흔들림으로 플라스크를 흔들어 150 개의 연구 과학자 애슐리 허친슨 (Ashley Hutchinson)은 다음과 같은 프로토콜을 시연 할 것입니다. 기하급수적으로 성장하는 SF9 세포와 곤충 혈청 프리 미디어 4리터를 밀당 400만 개의 최종 세포 밀도로 나누어 큰 5리터 시약병으로 나눕니다.
바쿨로바이러스 감염 곤충 세포의 현탁액 배양10~12마일을 추가한다. 72~96시간 동안 섭씨 25도의 낮은 온도에서 145 RPM을 흔들어 셰이커에서 SF9 세포의 감염된 배양을 배양한다. SF9 세포에서 바쿨로바이러스 즉각적인 생산에서 PRMT 가족에서 발현되는 여러 재조합 단백질의 밀리그램 양은 5그림에서 볼 수 있듯이 생화학적 생물리학적 교육 연구에 사용된다.
SGC에서, 결정 구조는 다양한 화학 프로브 및 억제제와 함께 PRMT4, 6, 7 및 9단백질의 전체 길이 또는 잘린 형태에 대한 단백질 데이터 뱅크에 증착되었다. 이러한 PRMTs에 대한 발현 플라스미드는 SGC에 의해 유전자 수집을 추가하기 위해 증착되었고 연구 커뮤니티에 사용할 수 있습니다. 이 비디오에서는 바쿨로바이러스 발현 시스템에서 대규모 생산에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제의 다중 구조의 성공적인 탐험 스크리닝을 위한 핵심 요소를 강조했습니다.
정기적인 조절 가능하고 프로그래밍 가능한 멀티 채널 파이펫을 사용하면 전체 프로세스가 효율성보다 더 빠르게 증가했습니다. 세포에 대한 고성능 및 독성이 적고 재조합 바이러스 생성을 위한 트랜스페트 시약의 사용은 비용 효율적이고 이 세포 처리 형질 전환 프로토콜을 주도했습니다. 6개의 세포에 감염된 바쿨로바이러스의 현탁액 배양을 가진 단백질 생산을 위한 대규모 배치의 감염은 중요한 스타터 증폭에 있는 시간 소모적인 단계에서 노동을 현저하게 감소시다.
예를 들어, 감염된 세포의 특별한 배양으로 원심분리. 그것은 물론 바이러스 저하에 있는 그들의 단단한에서 피하기에 있는 감염된 세포의 추가 취급을 제외합니다. 배양용기에서 의대규모 생산에서 현탁액 배양세포 유지보수는 높은 현장 부피로 생산량의 한계를 극복하고 대규모 플랫폼을 채택하는 데 도움이 되었다.
이는 생물 반응기 또는 생산 파이프라인의 공간이 제한된 실험실에 매우 유용합니다. 우리의 프로토콜은 단백질 아르기닌 메틸 전달기 가족의 단백질에 대해 설명되었지만, 동일한 접근법은 생화학적 생물 물리학 연구를 위한 단백질의 충분한 양을 얻기 위하여 발현 플랫폼을 요구하는 그밖 단백질 가족에 적용될 수 있습니다.
