이 프로토콜은 사용자가 대체 접합을 겪을 수 있는 게놈 발현 시스템을 생성할 수 있고 이 경우 자신의 기능 및 질병 협회를 위해 테스트할 수 있는 원형 RNA를 형성할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 사람들이 순환 RNA 형성 및 기능에 대체 접합을 연구 할 때 분자 생물학 및 복제에서이 프로토콜을 사용하는 길을 열 것입니다. 처음으로이 기술을 시도하는 사람에게 내 조언은 PCR 조건을 최적화하는 것입니다.
그라데이션을 실행하거나 서로 다른 어닐링 온도 및 확장 시간으로 터치 다운 PCR을 수행합니다. 일반적으로 6KB 이상의 긴 조각은 사이클당 1KB를 연장하고 다른 어닐링 온도는 최상의 증폭을 위해 테스트해야합니다. 이 방법의 데모는 사용자에게 절차의 더 어려운 측면, 특히 프라이머 생성의 더 어려운 측면을 더 잘 시각적으로 표현할 수 있기 때문에 중요합니다.
이 절차를 시작하려면 UCSC 게놈 브라우저를 로드하고 순환 RNA 형성에 필요한 반복적 인 요소를 식별하고 구조에 통합하는 데 사용합니다. 중요한 것은 증폭을 위한 프라이머가 반복적인 요소 외부에 있어야 한다는 것입니다. 원형 RNA 서열을 인간 BLAT 검색에 붙여 넣고 올바른 유기체를 선택합니다.
시퀀스를 제출하고 브라우저 보기로 이동하여 1.5 타이머를 축소하거나 적절하게 축소합니다. 다음으로 반복 요소 위에 마우스를 사용하여 부동 창에서 하위 형식을 식별합니다. Alu 요소는 죄 줄에 있습니다.
창 아래의 기본 트랙 버튼을 사용하여 잘못된 이미지를 가져오는 경우 브라우저를 재설정합니다. 먼저 USCS 게놈 브라우저의 맨 위 라인에 있는 DNA를 보고 창에 표시된 DNA 서열을 다운로드합니다. 시퀀싱 서식 옵션에서 확장된 케이스/색상 옵션을 선택합니다.
기본 케이스를 아래쪽케이스로 선택하고 NCBI RefSeq의 토글 케이스를 선택합니다. 반복 마스크에 대한 밑줄과 대담한 기울임꼴을 선택합니다. 제출을 클릭합니다.
대문자로 엑손과 소문자로 인트론이있을 것입니다. 엑손/인트론 테두리를 확인합니다. 브라우저에 역 방향 보완체가 표시되면 올바른 엑손/인트론 테두리가 표시될 때까지 역 방향 보완 상자를 선택합니다.
다음으로 올바른 방향으로 파일을 워드 프로세싱 문서에 복사하고 EXons를 강조 표시합니다. 이러한 영역의 프라이머가 특정 시퀀스를 증폭하지 않으므로 인트론이 반복 영역에서 시작되거나 끝나지 않도록 증폭될 조각을 선택합니다. 먼저 웹 도구를 사용하여 복제를 위한 프라이머를 디자인합니다.
벡터 서열의 경우, 삽입 부위를 마지막 뉴클레오티드로 추가하고 그 후 단편을 추가한다. 벡터 번호매기는 지정된 삽입 부위로 시작되지 않기 때문에 벡터내 삽입 부위가 위치하고 다운스트림 부분이 업스트림 서열 앞에 배치된다. 녹는 점이 섭씨 4도 이상이고 증폭효과가 없는 경우 프라이머를 조정합니다.
이 연구에서는, 원형 RNA를 생성하는 기자 유전자는 복제되고 분석됩니다. 최적화된 PCR 제품은 1X 젤 그린을 함유한 1%아가로즈 젤로 분리되어 있습니다. 개별 밴드는 효소 DNA 어셈블리에 사용되는 PCR 제품을 나타냅니다.
이 밴드는 젤에서 잘라 정제됩니다. 정제 된 PCR 제품은 젤 그린으로 예상 된 크기에 충실하게 실행되지 않으므로 제품은 1 % 아가로즈 젤에 분리되어 제품이 에티듐 브로마이드로 염색되어 제품이 올바른 크기인지 확인합니다. 시작하려면 효소 DNA 어셈블리 키트를 설정합니다.
벡터와 인서트를 1~2의 어금니 비율로 결합합니다. 다음으로, DNA 어셈블리 마스터 믹스의 10 마이크로 리터를 추가합니다. 50도에서 60분 동안 샘플을 배양합니다.
인큐베이션 중에 얼음에 유능한 세포를 해동하십시오. 세포는 50 마이크로 리터의 부피에 있어야합니다. 다음으로, 총 조립 반응으로 유능한 세포를 변환합니다.
차가운 조립 된 제품의 마이크로 리터 두 개를 유능한 세포에 추가하십시오. 튜브를 4~5번 가볍게 가볍게 가볍게 쓸어섞으세요. 소용돌이하지 마십시오.
혼합물을 얼음 위에 30분간 놓습니다. 혼합물을 섭씨 42도에서 30초 동안 열 충격을 가합니다. 그런 다음 2 분 동안 얼음에 다시 놓습니다.
그 후, 튜브에 실온 SOC 매체의 950 마이크로 리터를 추가합니다. 300 RPM에서 흔들면서 섭씨 37도에서 60분간 배양합니다. 이 잠복기 동안 적절한 항생제를 포함하는 두 개의 선택 플레이트를 따뜻하게하십시오.
인큐베이션에 이어 반응관을 10, 000g에서 30초 동안 원심분리하여 세포를 펠릿하고 한 선택 판에 세포의 25%, 다른 쪽은 75%를 플레이트에 내놓습니다. 이 접시를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 당신이 트랜스펙트하기 전에, 제한 소화에 의해 DNA를 확인합니다.
여기서, 9-12까지 의 엑슨을 포함하는 대표적인 타우 미니진은 주요 재조합을 배제하기 위하여 표시된 제한 효소로 절단됩니다. 트랜스펙트의 경우, 먼저 pH 2에서 밀리리터당 1밀리그램의 농도로 물에 선형 폴리에틸렌 염산염을 용해하십시오. 수산화 나트륨을 사용하여 0.22 마이크로미터 필터로 최대 7개까지 pH를 가져오고 용액을 멸균 필터로 사용할 수 있습니다.
사용할 준비가 될 때까지 솔루션을 섭씨 4도에 보관하십시오. 그런 다음 세포를 6웰 플레이트의 우물로 분할하고 10 %의 FBS를 포함하는 DMEM 미디어에서 하룻밤 동안 성장하게합니다. 다음 날, 멸균 관에 보고된 유전자의 1마이크로그램을 알리쿼트와 200마이크로리터의 멸균 살균 된 150 밀리머 나트륨 염화 나트륨을 추가합니다.
소용돌이에 의해 혼합. 다음으로, DNA의 각 마이크로그램에 대한 폴리에틸렌민의 3개의 마이크로리터의 비율로 이 혼합물에 폴리에틸렌광 용액을 추가합니다. 원심분리기는 튜브 의 바닥에 샘플을 수집하기 위해 간단히 합니다.
샘플을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 HEK293 셀에 직접 추가합니다. 이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 세포를 배양합니다.
다음 날, RNA 절연 키트를 사용하여 RT-PCR용 RNA를 분리한다. 인간 뇌 조직에서 유래한 2개의 샘플에서 cDNA는 원형 RNA 프라이머 circ tau exon 1210 역전 및 circ tau 엑슨(1211)으로 증폭된다. 타우 원형 RNA에 대응하는 예상 대역이 보이지만, 다른 강한 대역은 인간 게놈과 일치하지 않는 유물이다.
본 실험은 동일한 PCR 조건으로 반복되지만, 역전사는 순환타우 엑슨(1210)의 역프라이머로만 수행되었다. 예상 밴드만 증폭되고 시퀀싱을 통해 검증됩니다. RNA는 선형 RNA를 제거하는 RNase R로 처리됩니다.
원형 RNA는 치료 후 검출할 수 있는 반면 선형 RNA는 더 이상 검출 가능한 신호를 제공하지 않습니다. RNA는 24시간 후 트랜스페션을 격리하고 RT-PCR에 의해 분석된다. 선형 타우 mRNA의 증폭은 엑슨 10의 대체 접합으로 인해 두 개의 밴드를 나타낸다.
이들의 비율은 접합 요인의 과잉 표현으로 바뀝다. 원형 1210 tau RNA의 증폭은 특히 Cdc2와 같은 키나아제 CLK2 및 SR 단백질 9G8의 발현에 대한 타우 circ RNA 발현의 종속성을 나타낸다. 이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 미니 진을 생성 할 때 프라이머의 설계및 위치입니다.
프라이머는 반복적인 요소에 속해서는 안 되며 증폭되는 조각에 따라 다른 조건에서 최적화해야 합니다. 이 절차에 따라 수행할 수 있는 다른 방법은 원형 RNA의 기능을 테스트하는 것입니다. 사용자는 단백질의 번역 또는 격리를 테스트하여 사용자가 관심 있는 특정 원형 RNA에 대한 기능을 식별할 수 있다.
이 기술은 사용자가 자신의 기능을 테스트하고 식별할 수 있도록 원형 RNA를 표현할 수 있는 미니진 시스템에서 게놈 조각을 활용하는 길을 열어주었으며, 어떤 면에서는 질병과의 연관성을 테스트하고 식별할 수 있습니다. 이 기술의 연루는 특정 질병의 잠재적인 치료 및 진단으로 확장, 예를 들어 타우 병증, 타우 병리학과 관련 된 신경 퇴행성 질환. 우리는 MAPT로 알려진 microtubule 관련 단백질 타우가 질병 병리학에 기여하고 있다고 믿는 원형 RNA를 생성한다는 것을 발견했으며,이 방법은 이러한 원형 RNA를 완전히 연구하고 질병과의 관계를 식별 할 수 있습니다.
이 방법은 원형 RNA의 더 나은 이해, 그들의 기능이 무엇인지, 그리고 특정 질병에서 할 수 있는 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 방법은 그들의 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 종에 걸쳐 원형 RNA를 표현하는 다른 미니 유전자를 복제에 적용 할 수 있습니다. PCR 제품의 증폭은 단편 내에서 여러 반복적 인 원소를 갖는 것과 함께 게놈 DNA에서 증폭 된 긴 조각으로 가장 어려운 것으로 판명됩니다.
