이 방법은 신진 대사 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다, 노화 과정에서 신진 대사 활동이 어떻게 변경되는가. 이 기술의 주요 장점은 고전적인 미토콘드리아 격리에 비해 자연 및 생리 적 상태와 밀접하게 유사한 데이터를 가지고있는 그대로 신체 세그먼트의 사용입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원 생인 Anuroop과 Annika가 될 것입니다.
프로토콜을 시작하려면 실험을 시작하기 1시간 전에 기계를 켜서 원하는 온도에 도달하고 안정적으로 유지할 수 있는 충분한 시간이 되도록 합니다. 그런 다음, 소프트웨어 설정에서, 관리 모드에서, 카트리지 교정의 길이와 원하는 온도를 선택합니다. 그런 다음 다음 프로토콜을 입력합니다:실험 설계에 따라 선택한 측정 단계 후에 포트 A에서 D로 사출 단계를 추가합니다.
기저 OCR의 품질과 측정을 확인하려면, 포트 A.Prelibrate를 통해 첫 번째 약물의 주입을 설정하기 전에 적어도 세 측정 주기에 대한 프로토콜을 조정, 또는 테스트 하기 전에 적어도 4 시간, 각 우물에 교정의 1.0 밀리리터를 추가하여, 플레이트의 상단에 센서 카트리지를 배치. 증발을 방지하기 위해 24시간 이상 수분을 공급할 예정인 경우 파라필름으로 카트리지를 덮습니다. 하룻밤 사이에 CO2없이 섭씨 37도에 카트리지를 보관하십시오.
다음으로, 실험약물이 신선한 배지에 철저히 용해되고 2.5%의 포도당을 더한지 확인한다. 원하는 온도에서 차량의 pH에 대한 약물 용액의 pH를 측정하고 조정합니다. 피펫 에 약물 용액 할당 주입 포트.
그런 다음 카트리지를 컴퓨터에 로드하고 교정을 시작합니다. 1개의 정상 HCl로 원하는 pH에 신선하게 준비된 매체 플러스 2.5%의 포도당을 조정합니다. 다음으로, 얼음 상자를 준비하고 얼음에 금속 판을 놓습니다.
아일렛 플레이트 패키지를 엽니다. 16mm 페트리 접시로 미디어에 그물을 담그다. 삽입기로 하나의 그물을 수집하고 삽입자가 현미경 옆에 서있다.
삽입기에 연결된 그물에 작은 미디어 방울을 추가합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 금속 판에 놓아 파리를 마취시합니다. 집게를 사용하여, 비행의 복부를 잡고 현미경아래 페트리 접시에 미디어에 몰입.
두 번째 집게 를 사용하여 플라이의 머리를 부드럽게 제거합니다. 삽입기에 부착된 그물 의 중간에 머리를 놓고 머리가 미디어에 침지되는지 확인합니다. 머리를 중심으로 하여 머리를 잃지 않도록 하기 전에 불필요한 유체를 제거하여 우물에 놓습니다.
그물에 16 개의 머리가있을 때, 그들을 중심으로. 삽입기를 사용하여 그물을 우물에 놓습니다. 머리가 그물 아래에 갇혀 있는지 확인하고 천천히 700 마이크로 리터의 미디어 플러스 2.5 %의 포도당을 추가하십시오.
배경에 사용되는 빈 우물에는 버퍼700 마이크로리터와 2.5 %의 포도당이있는 그물이 포함되어 있는지 확인하십시오. 현미경을 통해 그물 아래 기포에 대 한 우물을 확인 합니다. 파이펫은 1밀리미터 파이펫을 사용하여 거품을 제거합니다.
신뢰할 수 있는 OCR 판독을 위해 머리를 중심으로 유지합니다. 그런 다음 접시를 기계에 추가하고 측정을 시작합니다. 프로토콜의 끝에서 카트리지를 제거합니다.
포트 충전재에 남은 것이 보이지 않는지 시각적으로 확인합니다. 다음으로, 머리가 단백질 추출에 사용되지 않는 경우 카트리지와 접시를 버리십시오. 분석 전에 비정상적인 우물을 감지하기 위해 산소와 pH 수준을 살펴보십시오.
또한 산소 수준에 따라 적절한 산소 소비 속도 계산을 선택하는 것이 중요합니다. 프로토콜을 수행하자마자 중년 머리의 산소 수준이 젊은 비행 헤드보다 더 빨리 떨어졌다는 것이 관찰되었습니다. 산소 레벨의 범위가 조건 간에 유사할 때, AKOS 알고리즘을 사용하여 산소 소비 속도를 자동으로 생성하는 것이 좋습니다, 또는 OCR, 이는 안정적으로 젊은 대 중년 머리 사이의 측정 중에 산소 수준 변화를 미러.
나트륨 부티레이트 또는 SB, KDAC 억제제의 첨가는 산소 수준의 역학을 일시적으로 변화시적으로 변화시다. 차량 컨트롤은 첫 번째 와 마지막 진드기 동안 산소의 꾸준한 수준을 표시하는 반면, SB 추가는 이러한 진드기에서 산소 수준의 상당한 과도 한 하락을 야기한다. AKOS 계산은 모든 진드기를 고려하고 무산소 상태를 무시하기 때문에 포트 A.의 주입시 거의 변화를 보이지 않는 비정규화된 AKOS 기반 OCR 수준에서 관찰된 것과 같이 오해의 소지가 있는 OCR을 생성합니다.OCR 및 산소 수준 변화와 보다 밀접하게 모델되고 유사한 고정 알고리즘은 SB 치료에 따라 OCR이 증가된 것으로 나타났습니다.
이 절차를 시도할 때, 한 접시를 준비하는 데 상대적으로 짧은 시간을 보장하기 위해 두 사람과 함께 작업하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 웨스턴 블롯 및 질량 분석과 같은 다른 생화학 적 방법은 분자 메커니즘과 관련된 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다, 예를 들어, 그 중간 대사 변경.
