그래서 우리의 새로운 기술의 주요 장점은, 우리는 농축 플러스 확장을 의미 E 플러스 E라고, 우리는 농축 플러스 확장을 의미, 우리는 농축하고 이러한 세포를 확장 할 수 있다는 것입니다, 희귀 항원 특정 세포, 동시에. 이것은 우리가 다른 설정에서 그리고 다른 임상 조정에서 그들의 역할을 조사하기 위하여 이용될 수 있을 세포의 충분한 수를 개발하는 것을 허용하거나 조차 우리가 전에 는 없었던 방식으로 면역 요법을 위해 이용할 수 있는 세포의 지금 많은 수를 개발할 수 있습니다. 우리가 개발한 방법, 이 E 플러스 E는, 신유전학의 존재에 관하여 기본적인 면역학에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다.
신유전학이란 무엇입니까? 그(것)들은 우리가 지금 암 면역 요법 및 또한 항원 특정 역학의 관점에서 지금 아주 중요하고 이 요인이 질병 상태 및 효과적인 세포 치료에 어떻게 영향을 미치는지 알고 있는 개인화한 전형입니다. 이 기술의 의미는 나노 입자 인공 항원 제시 세포가 개별 적인 참을성 있는 면역 반응에 쉽게 맞추어진 기성 품일 수 있기 때문에 면역 요법으로 확장됩니다.
나노입자 인공 항원 제시 세포를 생성하기 위해, 리오필화된 입자를 재서스펜션 버퍼의 1밀리리터로 재보중단하고 골재가 보이지 않게 될 때까지 적어도 15분 동안 현탁액을 적극적으로 소용돌이시킵니다. 단백질과의 반응 전에 충분히 소용돌이및 재중단되지 않은 입자는 해리될 수 없는 더 큰 응집입자를 초래할 것이다. 마그네틱 입자를 마그네틱 스탠드에 놓고 상체를 제거하고 0.5 밀리리터의 신선한 재서스펜션 버퍼로 재보힙니다.
입자 현탁액을 골재가 보이지 않게 될 때까지 소용돌이를 위해 유리 신경병 병으로 옮기고, 재중단 된 입자의 1 밀리그램당 총 자극 신호 0.1 밀리그램을 추가합니다. 소용돌이 후, 서스펜션이 회전기에서 혼합과 실온에서 2.5 시간 동안 반응 할 수 있도록, 혼합과 실온에서 추가 30 분 배양에 대한 담금질 버퍼의 0.1 밀리리터의 추가. 두 번째 반응의 끝에서, 마그네틱 스탠드에 신경병 유리병을 놓고 재서스펜션 버퍼 1밀리리터로 입자를 4번 세척하고, 세척 후 깨끗이 회전할 때 버퍼를 제거하고 자석에 대한 후속 세척을 위한 신선한 재서스펜션 버퍼로 교체한다.
마지막 세척 후 용액을 흡인하고 마그네틱 스탠드에서 입자를 제거한 다음 입자를 최대 6개월 동안 섭씨 4도에 신선한 재서스펜션 버퍼 1밀리리터에 보관합니다. 항원 별 CD8+T 세포를 분리하기 위해, 야생형 C57 블랙 6J 마우스의 비장과 림프절을 살균, 70마이크로미터 세포 스트레이너를 자주 PBS 헹구는 것으로 제거하고, 비CD8+T 세포를 제거하기 위해 제조업체의 지침에 따라 노터치 CD8+T 세포 격리 키트를 사용합니다. 계산 후, 원심분리에 의해 격리 된 CD8 +T 세포를 수집하고 0.5 %의 소 혈청 알부민과 2 밀리머 EDTA로 보충 된 PBS의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 재일시 중단, 그런 다음 나노입자 인공 항원 제시 세포로 세포를 배양하여 11번째 펩타이드 로드 MHC-ig에 1회 10회당 10회 가멸된 CD8+T 세포로 세포를 배양합니다. 5 밀리리터 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브는 섭씨 4도에서 1시간 동안 연속적으로 혼합됩니다.
인큐베이션의 끝에서, 입증된 바와 같이 자기 스탠드에서 나노입자 세포 현탁액을 3회 세척하고, 인공 항원 제시 세포및 농축CD8+T 세포를 500 마이크로리터의 신선하고 보충된 배지에서 마지막 세척 후 1%T 세포 성장 인자를 재연한다. 최대 세포 회수를 위해, 입자와 세포를 자기 컬럼에 2분 이상 두고 자기장에 영향을 미치는 입자와 세포를 방해하지 않고 조심스럽게 버퍼를 흡인하는 것이 중요합니다. 세고 후, 종자 2.5배 10에서 5번째로 농축된 CD8+T 세포및 96웰 U-바닥 플레이트에서 보충 된 배지의 160 마이크로 리터 당 자기 입자 혼합물.
셋째 날에는, 잘 당 2%T 세포 성장 인자로 보충 된 배지의 80 마이크로 리터로 세포를 공급하고 4 일 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 반환합니다. 7일째에 자극된 세포를 5밀리리터 둥근 바닥 튜브로 수확하여 계산하고 원심분리에 의해 세포를 수집합니다. PBS의 0.5 밀리리터에서 펠릿을 재중단하여 0.05%의 나트륨 아지드와 2%의 태아 소 혈청을 계산용으로 보충하고 5회에서 4~5회 10회에 5회 에서 5회 까지 의약성분 염색을 위한 새로운 5밀리리터 라운드 바닥 튜브로 보충하였다.
생체 화 된 MHC-ig 및 항 마우스 CD8a와 적절 한 튜브를 섭씨 4도에서 1 시간 동안 라벨, 신선한 PBS에서 원심분리기 세척을 통해 과잉 생체분해 면역글로불린을 제거한 다음, 적절한 연쇄타비딘 접합이 이차 항체로 샘플을 염색하고 4°C에서 15분 동안 적절한 살아있는 고칠 수 있는 죽은 세포 균주와 적절한 살아있는 고칠 수 있는 죽은 세포 균주를 4°C에서 제거하고, 항원 특이적 T8 의학적 특성을 결정하기 위해 혈중 세포에 세포를 판독한다. 여기서 성공적인 단백질 융합은 입자에 대한 단백질 부착의 세 가지 상이한 방법을 사용하여 달성되었다. aAPC 리간드 밀도가 너무 낮으면 항원 특이적 CD8+T 세포의 효과적인 자극이 없을 것이다.
바이오티닝 디머의 품질 관리는 염색을 확인하기 위해 형질CD8+T 세포에서 완료될 수 있다. 예를 들어, 이러한 대표적인 결과는 비항원 특이적 b6 CD8+T 세포를 배경 대조군으로 결합한 CD8+T 세포를 가진 양성 염색을 보여 준다. 또한, 생체 비뇨기림의 배경 염색에 대한 지식은 코그탄 염색 튜브에 있는 이 염색보다는 어떤 백분율든지 더 낮은 임의의 백분율이 부정적인 결과로 간주되어야 하기 때문에 중요합니다.
7일간의 농축 및 팽창 후, 10~4번과 2회 사이에 제5항제특이성 및 5~50%CD8+T 세포는 원래 5회부터 제6차 내인성 CD8+T 세포 개시 집단까지 기대할 수 있다. 동일한 방법론은 농축 후 1주일 만에 관찰된 항원 특이적 CD8+T 세포의 백분율 및 수의 유사한 증가를 가진 인간 항원 특이적 CD8+T 세포를 분리하고 자극하는 데 사용될 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 설명된 대로 적절한 시약 품질 검사를 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 세포내 세포사구균 염색 또는 표면 단백질 발현에 대한 유동 세포측정과 같은 다른 방법은 세포의 기능성 또는 표현형에 대한 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다. 이 기술은 암, 전염병 또는 자가 면역 연구와 같은 그밖 생물 의학 필드에 있는 항원 특정 반응의 폭, 깊이 및 역학을 탐구하는 기본적인 면역학 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장합니다.
