이 방법은 인간 유도만능 줄기 세포 유래 내피 세포의 기능성 및 염증 반응에 대한 인간 만능 줄기 세포 생물학 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 유도만능 줄기 세포 유래 내피 세포에 대한 백혈구 접착의 평가를 위한 실험 설정 및 데이터 분석에 대한 상세한 설명을 제공한다는 것이다. 미세 유체 칩 코팅의 경우 멸균 바이오 칩을 10센티미터 멸균 페트리 접시에 넣고 10 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 갓 준비된 fibronectin 작동 용액 10 마이크로리터를 바이오칩의 각 채널에 주입합니다.
페트리 접시를 덮고 밤새 4도의 가습챔버에 놓습니다. 다음날 아침, 바이오칩을 섭씨 37도 인큐베이터로 미리 데우고, 신선한 내피 세포 혈청이 없는 배지에서 원하는 농도에서 80~100%의 원소 세포 배양에서 수확된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 내피 세포를 다시 중단한다. 다음으로, 마이크로유체 칩의 모든 채널에서 섬유네틴 용액을 흡인시키고, 세포를 철저히 혼합하여 10마이크로리터 파이펫 팁을 사용하기 전에 균질세포 현탁액을 획득하여 각 채널에 6마이크로리터의 세포를 주입한다.
현미경의 밑에 바이오칩을 검사하여 세포가 높은 세포 밀도로 균일하게 분포되어 있는지 확인합니다. 섭씨 37도에서 15분 후, 각 채널의 양쪽에 있는 중간 저수지에 내피 세포 혈청 없는 매체 FULL 40 마이크로리터를 추가합니다. 그리고 바이오칩을 인큐베이터에 1시간 동안 반납한다.
그런 다음 내피 세포 혈청없는 배지 FULL 50 마이크로 리터를 각 채널의 양쪽에 있는 저수지에 추가합니다. 시드 세포의 라이브 이미징의 경우, 미세 유체 설정이 준비되고, 라이브 이미징 챔버가 섭씨 37도로 평형화되고, CO2 수준이 5%에 도달하여 바이오칩을 현미경 칩 홀더에 넣고 칩 홀더를 현미경 이미징 단계에 장착하는지 확인합니다. 매니폴드를 통해 바이오칩을 펌프에 연결하려면 8핀 어댑터를 칩의 콘센트 저장소 에 가깝게 놓고 핀을 완전히 연결하지 않고 매체의 모든 핀을 깊게 합니다.
미세 유체 펌프 소프트웨어에서 Washout/Connect 칩을 선택하고 실행 분석 단계를 클릭하여 각 핀을 통해 RPMI 배지 30 마이크로리터를 분배합니다. 그런 다음 바이오칩의 콘센트에 8핀 어댑터를 삽입합니다. 파이펫을 사용하여 바이오칩의 모든 입구 저장소에서 배지를 수동으로 흡인하고, 워시아웃/칩 워시아웃 및 런 분석 단계를 선택하여 내피 세포 혈청 이음새 가 없는 배지 40마이크로리터로 한 번에 하나의 채널을 배분하여 죽은 세포와 잔해를 제거합니다.
모든 채널이 세척되면 관심있는 채널의 입구 저장소로부터 배지를 100 마이크로리터로 대체하여 RPMI 배지에서 밀리리터 농도당 2.5배 10배10로 희석된다. 셀 분석/단계 설명을 클릭하고 현재 채널/단계 설명을 설정하고 관심 있는 채널을 켜기로 설정하고 다른 7개 채널을 끄기로 설정합니다.
입구 저장소의 나머지 백혈구를 완전한 RPMI 배지 100 마이크로리터로 교체하십시오. 그리고 셀 분석 단계 설명 및 실행 분석 단계는 RPMI 매체와 5 분 동안 채널을 perfuse 어떤 비 부착 백혈구를 제거합니다. 그런 다음 채널에서 3~4개의 서로 다른 위치에서 이미지를 획득하여 부착된 백혈구를 시각화합니다.
준수 백혈구를 정량화하려면 CellProfiler 이미지 처리 소프트웨어를 열고 백작 백작 파이프라인 파일을 가져옵니다. 입력 모듈 에서 이미지를 선택하고 폴더를 파일 목록 창에 부착된 백혈구의 원시 이미지와 함께 폴더를 드래그 앤 드롭합니다. 분석 모듈에서 기본 개체 식별을 선택하고 픽셀에서 부착백백세포의 최소 및 최대 직경을 나타냅니다.
분석 모듈에서 필터 오브젝트를 선택합니다. 그런 다음 필터링 조건을 선택하고 픽셀단위로 개체의 최소 허용 영역을 입력하고 이미지 분석을 클릭하여 분석을 시작합니다. 최적의 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내피 세포 해리는 세포 덩어리가 없는 단일 세포 현탁액을 초래한다.
전형적으로, 주입 후 15분 동안 내피 세포가 채널의 바닥에 부착되어 퍼지기 시작합니다. 주입 후 1시간 이내에 내피 세포는 채널 전반에 걸쳐 잘 퍼진 단층층을 형성해야 하며, 이 때 흐름 분석에서 사용할 준비가 되어 있습니다. 입증된 바와 같이 무료 오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어를 사용하면 최소한의 영역에 따라 식별된 물체를 필터링하고 셀 이물질, 자동 형광 또는 기타 비특이적 형광 신호와 같은 거짓 식별 된 물체를 제외 할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안, 프로 염증 성 사이토카인으로 자극을 최적화하고 양성 대조군으로 1 차적인 인간 적인 심부 정맥 내피 세포를 포함하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 1 차적인 포유류 세포 및 세포주를 가진 일하는 것은 극단적으로 위험할 수 있고 실험실 외투, 장갑 및 눈 보호를 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
