이 방법은 미생물학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다, 부상이나 질병 후 단일 세포의 수천에 걸쳐 유전자 발현 변화를 이해하는 등. 이 기술의 주요 장점은 복잡한 조직 내에서 개별 세포의 전사를 해부하고 주어진 인구 내에서 기능적 역학을 더 잘 이해할 수 있다는 것입니다. 프로토콜의 장점은 1차 조직에서 단일 셀의 격리에서부터 이 데이터 집합의 분석 및 시각화에 이르기까지 포괄적인 방법을 제공한다는 것입니다.
이 방법은 피부와 신경에서 단세포 현탁액에서 시작되지만, 우리가 설명하는 시퀀싱 방법은 모든 포유류 조직을 연구하기 위해 적용 될 수있다. 이 절차를 시연하는 것은 로디 라비트와 내 실험실에서 온 두 명의 연수생인 신위수입니다. 시작하려면, 먼저 마우스의 뒤쪽의 뒷부위에서 피부를 절단하여 안락사 마우스의 상시 신경을 해부.
멸균 메스 블레이드를 사용하여 허벅지 길이를 따라 절개를 합니다. 그런 다음 미세 한 집게와 가위를 사용하여 좌골 신경을 노출하고 제거하십시오. 등불 뒤쪽 피부를 해부하려면 미세한 집게와 가위를 사용하여 어깨에서 어깨, 엉덩이를 가로 질러, 그리고 뒤쪽으로 절개를합니다.
얼음 차가운 HBSS로 조직을 두 번 씻으시면 됩니다. 해부 현미경에서 원치 않는 결합 조직, 지방 예금 또는 이물질을 제거하십시오. 피부만을 위해, 멸균 메스 블레이드를 사용하여 얇은 조각으로 피부를 잘라.
피부 진피를 얻으려면, 10 센티미터 접시에 HBSS에 디스파스에 피부 조각을 플로트, 37섭씨37도에서 30 ~ 40 분 동안. 미세 한 집게를 사용하여 표피를 벗겨 진피에서 분리한 다음 표피를 폐기하십시오. 그런 다음 피부와 신경을 위해 멸균 메스 블레이드 한 쌍을 사용하여 각 샘플을 1 ~ 2 밀리미터 조각으로 다진다.
15 밀리리터 원추형 튜브에 밀리리터 콜드 콜라게나아제-4 효소 당 2그램의 티슈 피스를 갓 해동합니다. 37도의 섭씨 욕조에서 효소에 각 샘플을 30분 간 배양하여 10분마다 부드럽게 흔들어 보시고 있습니다. 30분 만에 P1000 피프터를 사용하여 조직을 20~30회 세리세게 하고 수조로 돌아갑니다.
용액이 흐릿해 질 때까지 30분마다 반복하여 조직 덩어리가 크게 해리됩니다. 피부만을 위해, 인큐베이션의 마지막 시간에, 피부 샘플에 밀리리터 DNAse 당 1 밀리그램을 추가합니다. 일부 세포 유형은 기계적 스트레스에 다른 사람보다 더 민감하기 때문에 과도한 해리 기술은 인구를 편향시킬 수 있습니다.
일반적인 해리는 높은 세포 수율을 달성하고 조직 구성의 정확한 표현을 달성하는 데 중요합니다. 그 후, 50 밀리리터 원판 튜브 위에 40 마이크로미터 필터를 사용하여 각 조직 샘플을 두 번 필터링하십시오. 1%의 BSA/HBSS로 필터를 헹구습니다.
원고에 설명된 바와 같이 샘플을 원심분리한 후, HBSS의 세포 펠릿을 다시 중단하고, 1% BSA를 함유하고, 넓은 보어 팁을 사용하고, 얼음 위에 놓습니다. 생존 성 염료를 첨가하면 준비를 최적화하는 데 도움이됩니다. 당신은 적어도 목표로해야 80 % 실행 가능한 세포.
최적화되면, 이 및 그밖 품질 통제 단계는 RNA 질을 더 잘 보존하고 세포 손실을 감소시키는 해리 프로세스를 서두르기 위하여 생략될 수 있습니다. FACS를 사용하여 실행 가능하고 건강한 세포를 격리하려면 먼저 샘플 수집을 위해 8 밀리리터의 얼음 냉기 1% BSA/HBSS로 15밀리리터 좁은 바닥 튜브를 준비합니다. 액체 표면과 튜브 내부 사이의 인터페이스가 촉촉하고 정적 및 표면 장력을 방지하기 위해 수집 전에 튜브를 반전시려면.
FACS 세포 선별 직후, 세포가 15 밀리리터 튜브에서 수집되면, 1%의 BSA/HBSS의 1밀리리터를 사용하여 모든 세포를 세척하고 튜브의 측면 표면에서 아래로 밀어 넣습니다. 그런 다음 각 샘플을 260g에서 8분 동안 원심분리합니다. 상체를 폐기한 후, 세포 펠릿을 1% BSA/HBSS로 다시 중단하고 튜브에 33.8 마이크로리터를 추가하고 그 튜브를 얼음 위에 보관합니다.
이 단계는 표준화된 키트에서 얻은 시약을 사용하여 수행되도록 설계되었습니다. 입증된 모든 단계는 제조업체의 지침에 따라 수행해야 합니다. GEM 생성을 준비하기 위해 칩 홀더에 칩을 배치하여 제조업체의 프로토콜에 따라 얼음에 셀 마스터 믹스를 준비합니다.
마스터 믹스의 56.2 마이크로리터를 33.8 마이크로리터의 자체 서스펜션이 들어있는 튜브에 추가합니다. 칩을 준비하려면, 먼저 50 % 글리세롤에서 사용하지 않을 우물에. 그런 다음 셀 마스터 믹스의 마이크로리터 90개를 잘 1개, 젤 비드 40마이크로리터에 2개, 분할 오일 270마이크로리터를 3개에 잘 넣습니다.
개스킷으로 칩을 덮습니다. 칩을 로드하고 단일 셀 컨트롤러에서 실행하려면 먼저 트레이를 배출합니다. 칩을 트레이에 놓습니다.
트레이를 철회하고 재생을 누릅니다. 전체 실행 후, 샘플의 100 마이크로 리터를 수집하고 PCR 튜브에 배치합니다. PCR 튜브를 미리 설정된 PCR 기계에 놓고 키트에 따라 실행합니다.
실행 후, GEM은 폴리아데니얼 된 mRNA에서 전체 길이, 바코드 cDNA를 포함한다. 하룻밤 사이에 튜브를 영하 20도에 놓습니다. 라이브러리 구성, 시퀀싱, 정렬 및 분석을 진행합니다.
샘플이 원고에 설명된 대로 시퀀싱되고 정렬되면 NCBI의 GEO와 같은 공용 저장소에 데이터를 예치합니다. 이렇게 하려면 제출자 계정에 등록합니다. 먼저 메타데이터 시트를 다운로드하여 GEO 제출을 완료합니다.
프로젝트 제출당 메타데이터 시트를 하나만 포함해야 합니다. 스프레드시트를 디렉터리에 배치합니다. 둘째, 디렉터리에 모든 라이브러리에 대한 셀 레인저 카운트 스크립트에서 생성된 원시 데이터 파일을 추가합니다.
세 번째 폴더는 처리된 데이터 파일입니다. 모든 라이브러리에 대한 셀 레인저 수 스크립트에서 생성된 처리된 데이터 파일을 디렉터리에 배치합니다. GEO 제출자의 FTP 서버 자격 증명을 사용하여 세 가지 구성 요소가 모두 포함된 디렉터리를 전송합니다.
세포 레인저를 실행 한 후, 분석 준비 유전자 바코드 행렬고급 생물 정보학을 사용하여 추가 처리 될 수있다. 첫째, 전처리 수량 검사는 세포 이중및 이상값을 확인하기 위해 유전자 수, 독특한 분자 식별자 수 및 미토콘드리아 유전자의 백분율을 시각화하기 위해 바이올린 및 분산 플롯을 생성한 Seurat R 패키지를 사용하여 수행되었습니다. 주요 구성 요소 또는 PC의 선택을 위해, 팔꿈치 플롯이 사용되었으며, PC 축의 표준 편차의 고원을 넘어 있는 PC는 제외되었다.
클러스터링 해상도도 조작되었습니다. 낮은 해상도로 인해 셀 클러스터수가 줄어들었고 각 클러스터는 정의된 셀 유형을 나타냅니다. 고해상도는 세포 집단의 하위 유형 또는 과도기 상태를 나타내는 더 높은 세포 확률로 이어졌습니다.
저해상도 클러스터 설정은 지정된 클러스터에서 가장 높게 발현된 유전자를 식별하기 위해 발현 히트 맵의 추가 분석을 위해 사용되었습니다. 개별 후보 유전자는 tSNE 플롯에 시각화되었다, Seurat의 기능 플롯 기능을 사용하여, 그 해독을 허용, 나타내는 클러스터가 있었는지 여부, 예를 들어, 대식 세포. 클러스터 2와 4 모두 팬 대식세포 마커인 CD68을 발현하였다.
다른 패키지는 또한 품질 관리를 위한 도구를 제공합니다, 예를 들어, Monocle, 세포 궤적을 구축하는 데 사용되는 R 패키지, 가난한 품질의 세포를 제거하고, 모든 셀에 걸쳐 mRNA의 분포가 정상으로 로그되도록, 상부와 하한 사이에 떨어졌다. 그 때 단일 세포는 공지된 혈통 마커 유전자를 사용하여 분류및 계산되었고, 관심있는 마커를 발현하는 세포는 세포 유형 1에 할당되었다. 세포유형 1호는 섬유아세포라고 판단되었다.
이 인구는 섬유아세포 발달 궤적을 구축하기 위해 평가되었다. 이 절차에 따라, 정량적 PCR 과 같은 다른 방법, 시상 혼성화에서, 면역 화학은 유전자 발현 결과의 정확성을 확인하기 위해 수행되어야한다. 단세포 mRNA 염기서열분석은 이제 많은 다른 분야의 연구원들이 세포 간 이질성을 탐구하고, 항상성 동안 다른 조직 내의 기능적 역학을 식별하고, 부상 후 또는 질병의 발달 에서 어떻게 변화할 수 있는지에 대한 길을 열었습니다.
