이 방법은 뇌의 뇌세포 및 신경교 활동의 촉진과 뇌의 뇌척수 혈류를 직접 연결하는 실질 동맥 내피의 기능에 대한 더 나은 통찰력을 제공합니다. 세동맥 내피에 비해 뚜렷한 기술적 이점은 개별 뇌수 내피 세포와 각각의 소기관 간의 형태 학적 치수 및 칼슘 및 전기 신호 전달의 향상된 분해능입니다. 처음에는 뇌출혈 내피의 격리 및 검사가 매우 어려울 것입니다.
그러나 인내와 헌신을 동반 한 많은 연습으로이 기술을 습득 할 수 있습니다. 분리 된 뇌를 비커 또는 페트리 접시에 차가운 해부 용액으로 씻어 뇌 표면에서 남아있는 혈액을 제거하십시오. 복부 뇌 쪽을 위로 향하게 하여 차가운 해부 용액이 들어있는 챔버에 두어 실질 세동맥을 분리합니다.
실질 세동맥을 분리하려면 50 센티미터 이상의 깊은 숯이 주입 된 실리콘 폴리머 코팅이 들어있는 페트리 접시의 냉간 해부 용액에 강철 핀으로 분리 된 뇌를 고정하십시오. MCA 주위에 날카롭고 정렬 된 해부 가위로 양쪽 반구에서 뇌 조직의 사각형을 자르고 조직 세그먼트의 윗부분이 윌리스 원의 분기점을 지나도록하십시오. MCA가 강철 핀으로 위쪽을 향하도록 접시에 뇌 조직을 고정시킵니다.
조심스럽게 핀 근처에서 얕은 절개를 만들고 작은 집게로 피아를 제거하고 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 부드럽게 벗겨냅니다. MCA에서 분기 된 실질 세동맥으로 분리 된 피아를 핀으로 조심스럽게 고정하고 실질 세동맥을 조심스럽게 해부하십시오. 남아있는 원위 가지를 자르고 세동맥이 부착되지 않은 상태에서 깨끗한지 확인하십시오.
효소 소화를 위해이 깨끗한 손상되지 않은 세동맥을 사용하십시오. 또는 원하는 경우 내피 튜브를 준비하기 위해 효소 소화를 위해 각 세동맥을 두 조각으로 자릅니다. 동맥 세그먼트의 부분 소화를 위해, 손상되지 않은 동맥 세그먼트를 파파인, 디티오에리트리톨, 콜라게나제 및 엘라스타제가 들어있는 10 밀리리터 유리 튜브에 해리 용액 1 밀리리터에 넣으십시오.
동맥 세그먼트를 섭씨 34도에서 10 ~ 12 분 동안 배양하십시오. 동맥 내피 튜브를 분리하려면 마이크로 주사기 주입기와 함께 부착 된 분쇄 피펫을 챔버의 해리 용액에 놓고 소화 된 용기 세그먼트의 한쪽 끝 가까이에 위치시킵니다. 부드러운 분쇄를 위해 펌프 컨트롤러에서 초당 하나 ~ 세 나노 리터의 범위 내에서 속도를 설정하십시오.
100X 내지 200X 배율을 유지하면서 동맥 세그먼트를 피펫으로 인출한 다음 주입하여 재림과 평활근 세포를 해리시킨다. 모든 평활근 세포가 해리되고 내피 세포만 온전한 튜브로 남아있을 때까지 혈관 세그먼트를 트리튜레이트하십시오. 마이크로 조작기를 사용하여 챔버 내의 유리 커버슬립에 내피 튜브의 양쪽 끝을 보로 실리케이트 유리 핀닝 피펫으로 고정하여 내피막 전위를 측정하기 위해 4X 목표를 통해 보면서 동맥 내피 튜브의 셀 바로 위에 날카로운 전극 팁을 조심스럽게 배치하여 마이크로 조작기로 흐르는 생리 학적 염 용액으로 들어갑니다.
점차적으로 배율을 400X로 증가시키고 필요에 따라 전극 팁을 재배치하십시오. 마이크로 조작기를 사용하여 날카로운 전극의 끝을 내피 튜브의 셀 중 하나에 부드럽게 삽입하고 전자계를 사용하여 VM 기록을 시작하십시오. 내피 휴지 VM이 영하 30에서 마이너스 40밀리볼트까지 안정되면 실험 목적당 원하는 약리학적 제제를 적용한다.
내피 튜브를 원형질막 또는 원하는 소기관용 형광 추적기로 섭씨 37도에서 15 내지 30분 동안 로딩한다. 세포를 신선한 과융합 생리적 염 용액으로 세척하고 각각의 염료의 여기 파장에서 현미경으로 살아있는 세포를 이미지화한다. 내피 기능은 섭씨 37도에서 강력한 퓨리너기 수용체 작용제인 약리학적 제제 MTA에 반응하여 세포내 칼슘 및 막 전위를 측정함으로써 평가되었다.
하나의 마이크로몰 MTA를 적용하면, 수반되는 과분극과 함께 세포내 칼슘 농도가 급속히 증가한다. 또한, 무손상 내피를 형광 추적기와 함께 섭씨 37도에서 배양하여 세포 형태를 조사하기 위한 시각화를 수행하였다. 살아있는 내피 세포 영상은 원형질막과 핵에 대한 공동 염색을 보여주었다.
원형질막은 소포체 형광 염색과 함께 염색되었고, 이에 의해 원형질막의 근접성 내에서 ER의 겉보기 중첩의 영역이 주황색으로 나타난다. 실험자는 손상된 세동맥이 손상되지 않은 내피 튜브를 확실히 생성하지 않기 때문에 세동맥의 손상을 피하기 위해 해부와 격리 중에 조심해야합니다. 절차 후, 세포는 형광 항체를 사용한 고정된 면역조직화학 또는 소기관 및 막 지질의 살아있는 세포 염색에 사용될 수 있다.
이 기술은 생리학의 기본 수준에서 뇌 혈류의 기본 메커니즘을 이해하기위한 새로운 정보를 생성하고 치료를위한 병리학으로의 전환을 선택합니다.
