이 나노바 지지 지질 이중층 시스템은 세포 활동 중 단백질과 지질의 역학 및 분포를 조절하는 막 곡률의 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 고해상도 나노 제조에 의해 사전 정의 된 막 곡률로 특허 나노 바 오류에 연속적인 지질 이중층을 형성함으로써 막 곡률 생성에서 높은 서브 루트와 나쁜 것을 모두 제공합니다. 시작하려면 나노 칩을 패턴면이 위를 향하도록 10 밀리리터 비커에 넣습니다.
비커에 98 % 황산 1 밀리리터를 조심스럽게 추가하고 산이 칩의 앞면과 뒷면을 완전히 덮도록합니다. 비커를 천천히 돌리고 전체 비커가 뜨거워 질 때까지 200 마이크로 리터의 30 % 과산화수소를 한 방울 씩 추가합니다. 황산과 과산화수소가 잘 혼합되어 나노 칩에서 유기 분자를 제거하기위한 피라냐 용액을 형성하는지 확인하십시오.
비커를 보조 유리 용기에 넣고 나노 칩을 피라냐 용액에 밤새 담가 두어 불순물을 철저히 청소하십시오. 비커를 꺼내 피라냐 용액을 산성 폐기물 용기에 조심스럽게 피펫팅합니다. 5 밀리리터의 탈 이온수를 비커에 넣어 잔류 산을 희석하고 산성 폐기물로 버립니다.
이 단계를 다섯 번 반복합니다. 핀셋으로 칩을 잡고 탈이온수의 연속 흐름으로 세척하여 잔류 산을 완전히 제거합니다. SLB 형성을 위해 99.9 % 질소 가스로 칩을 불어 건조시킵니다.
지질 혼합물을 30 분 동안 초음파 처리하십시오. 지질 혼합물을 액체 질소에서 20 초 동안 동결시킨 다음 수조에서 섭씨 42도에서 2 분 동안 해동합니다. 동결/해동 주기를 30회 반복합니다.
그 후, 지질 혼합물은 투명한 액체처럼 보입니다. 지질 혼합물을 미니 압출기를 통과시키고 앞뒤로 20회 압출합니다. 반대쪽의 주사기에서 SUV를 수집하여 더 큰 입자 나 이물질로 인한 오염을 줄이고 1.5 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
한 쌍의 핀셋으로 탈 이온수에서 청소 된 나노 칩을 조심스럽게 꺼내고 99.9 % 질소 가스로 불어 건조시킵니다. 1시간 동안 공기 플라즈마 처리로 나노칩의 표면 세정을 수행한다. 나노 칩을 PDMS 챔버에 조립합니다.
패턴이 위를 향하도록 깨끗한 표면에 칩을 놓는 것으로 시작하십시오. 중간 PDMS를 칩으로 부드럽게 덮고 전체 패턴이 중간 PDMS의 큰 타원형 개구부의 중앙 영역에 노출되는지 확인합니다. 상단 PDMS를 중간 PDMS로 덮고 중간 PDMS의 큰 타원형 구멍 영역 내에 두 개의 작은 구멍을 유지하십시오.
이어서, PDMS 챔버가 조립된다. 피펫으로 상단 PDMS의 두 개의 작은 구멍 중 하나에서 SUV를 PDMS 채널로 로드하고 실온에서 15분 동안 배양하여 SLB를 형성합니다. PBS 버퍼를 작은 구멍의 한쪽에서 PDMS 채널로 부드럽게 피펫팅하고 다른 구멍에서 면봉으로 폐기물을 제거하여 바인딩되지 않은 SUV를 씻어냅니다.
그런 다음 나노 칩 상에 형성된 SLB를 획득한다. 100 x 오일 대물렌즈를 사용하여 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 설정합니다. Zen 소프트웨어를 열어 지질과 단백질의 형광을 자극할 수 있는 여기 레이저 출력을 선택합니다.
획득 모드를 선택합니다. 그런 다음 스마트 설정을 클릭한 다음 Texas Red를 클릭합니다. 초점 노브로 초점을 조정하여 나노 막대 가장자리가 지질 채널 아래에서 날카로워질 때까지 칩의 나노 막대를 찾습니다.
단백질을 추가하기 전에 지질 채널의 제어 이미지를 얻기 위해 스캐닝 파라미터를 설정합니다. 임의의 단일 나노바 영역에서 형광 표지된 지질 이중층으로 표백하여 FRAP 분석을 수행합니다. 실험 영역 및 표백 확인란을 선택합니다.
중앙에 전체 나노 바를 포함 할 수있는 직경 5 마이크로 미터의 원형 영역을 그리고 실험 영역에 추가합니다. 타임랩스 이미징 파라미터를 입력합니다. 시계열을 선택합니다.
그런 다음 기간을 클릭합니다. 100 사이클과 2초와 같은 간격을 선택합니다. 표백 매개 변수를 입력합니다.
FRAP를 수행하는 레이저 확인란을 선택하고 전원을 100%로 변경합니다. FRAP 실험에 대해 실험 시작을 클릭합니다. 단백질 용액을 PDMS 채널 내로 로딩하고 SLB 상의 단백질의 결합을 허용하기 위해 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 나노바의 초점을 다시 맞추고 스캐닝 파라미터를 설정하여 단백질 곡률 감지 감지를 위해 지질 및 단백질 채널의 이미지를 촬영합니다.
실험 영역을 선택하고 지질 및 단백질 채널 모두에서 FRAP 분석을 수행하고 TimeLapse 이미징을 수행하여 곡률 감지 단백질의 이동성을 특성화합니다. 둘 다 300 나노 미터 너비의 SLB 코팅 된 개별 나노 바의 끝 부분에 증가 된 축적을 보여줍니다. 여기서 SLB는 단백질 결합을 정전기적으로 향상시키기 위해 10%PS를 포함합니다.
두 단백질 모두 지질보다 말단 대 중심 비율이 높으며 이는 약 1입니다. IDR FBP17과 F-Bar를 비교할 때 IDR FBP17의 더 높은 끝 대 중심 비율은 F-Bar보다 더 강한 곡률 감지를 나타냅니다. 3 개의 단백질 모두 직경이 400 나노 미터 이하로 감소했을 때 곡률이 감소 할 때 나노 바 말단 곡선 막 부위에서 우선적 인 축적을 보였다.
이 세 가지 단백질 도메인 중에서 IDR FBP17은 가장 높은 나노 바 및 밀도를 제공하여 가장 강한 곡률 감지 능력을 나타내는 반면 F-Bar는 가장 낮은 값을 나타냅니다. 단백질 결합 곡선은 IDR FBP17이 강한 협력 곡률 감지 능력을 가지고 있음을 보여주는 단백질 농도를 점진적으로 증가시켜 플롯 할 수 있습니다. 나노바에서 지질 신호의 빠른 회복과 비교할 때, F-Bar는 2분 이내에 회복할 수 없으며, 이는 곡선 막 부위에서 막 이동성과 결합 역학이 크게 감소했음을 시사합니다.
놀랍게도, F-Bar의 거동과는 달리, IDR FBP17 신호는 동일한 기간 내에 명백한 회복을 보여 주며, 이는 곡선 멤브레인에 축적 된 IDR FBP17의 동적 특성을 나타냅니다. 그러나 솔루션에서 언바운드 IDR FBP17을 씻어낸 후 IDR FBP17 채널에서 이전과 동일한 복구가 관찰되지 않았습니다. SLB 품질은 곡곡 막과 단백질 간의 상호 작용을 연구 할 때 매우 중요합니다.
따라서 FRAP 테스트는 멤브레인 이동성을 검증하기 위해 실험에서 필요합니다. 이 시스템은 연구자들이 곡률 감지 도메인 및 지질 조성과 같은 곡선 막과의 단백질 상호 작용에 영향을 미치는 다양한 매개 변수를 연구하고 얼굴 분리 거동과 같은 곡선 막에 대한 동적 연구를 수행하는 데 도움이 될 것입니다.
