이 프로토콜을 통해 연구자들은 물방울 인터페이스 이중 레이어 또는 모델 멤브레인을 정확하게 가열할 수 있으므로 셀룰러 환경에서 발생하는 다양한 온도 관련 효과를 연구할 수 있습니다. 핵심 장점은 DIB의 전기 또는 광학 특성에 대한 액세스를 방해하지 않고 저용량 저수지에서 목욕 온도를 현지에서 측정하고 제어하는 기능에서 비롯됩니다. 유체 목욕을 정밀하게 가열하는 능력은 천연 세포 추출물을 포함하여 훨씬 더 다양한 막 성분에서 형성된 DIB의 운송 및 신호 특성을 연구할 수 있는 가능성을 열어주습니다.
이것은 충분한 실험 적 정확성을 달성하기 위해 밀접하게 따라야하는 여러 장비를 활용하는 다단계 프로토콜이므로 서면 프로세스의 모호성을 시각적 데모를 통해 명확히 할 수 있습니다. 길이 25x 40mm로 트리밍된 1mm 두께의 절연 고무 2개, 25x 40mm의 6mm 두께 고무 2개, 준비된 알루미늄 베이스 설비 어셈블리, 알루미늄 베이스 설비의 관측 창에 맞는 아크릴 오일 저장소 2개를 모으기 시작합니다. 각 조각의 긴 가장자리가 무대 개구부에 접선될 정도로 더 얇은 고무 조각을 현미경의 무대에 놓습니다.
알루미늄 베이스 설비를 절연 패드 위에 배치하여 목적 렌즈 위에 고정물의 시야 창을 배치합니다. 각 저항 가열 요소 위에 두꺼운 고무 조각을 배치한 다음 현미경 스테이지 클립을 사용하여 스테이지 클립으로 인한 손상으로부터 가열 요소를 보호하고 우발적 인 전기 단락으로부터 절연합니다. 열전대의 측정 끝을 조심스럽게 구부려 끝에서 약 4밀리미터에서 90도 각도를 달성합니다.
열전대의 구부러진 끝을 알루미늄 설비의 왼쪽 아래 모서리에 삽입하고 잠금 나사로 부드럽게 고정합니다. 아크릴 저수지를 알루미늄 설비의 우물에 넣은 후 알루미늄 설비의 우물에 헥사데카네 오일을 첨가하여 아크릴 저수지의 관측 창과 바닥 사이에 기포가 포획될 위험을 최소화합니다. 약 1, 000 마이크로리터의 헥사데카네 오일을 알루미늄 설비의 우물에 분배하여 오일이 현미경 단계 또는 객관적 렌즈에 고정물의 가장자리를 통해 유출되는 것을 허용하지 않는 동안 열 전달을 위한 최대 표면적을 제공합니다.
육사데카네 오일의 약 1, 000 마이크로리터를 과다 채우지 않고 아크릴 저수지에 분배합니다. 멤브레인지질의 열tropic 상 전이를 식별 하기 위해 이중 층 형성을 허용 하는 설정 된 지점에서 오일 목욕의 온도를 낮추는 동안 멤브레인의 명목 커패시턴스를 측정 합니다. GUI의 온도 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 디스플레이 데이터를 지우면 버퍼의 충분한 공간을 후속 레코딩에 사용할 수 있도록 합니다.
패치 클램프 증폭기에 연결된 파형 발생기를 사용하여, 액적 인터페이스 바이레이어 또는 DIB, 전극에 걸쳐 삼각형 전압 파형을 적용하고 바이레이어를 통해 유도된 전류 응답을 기록한다. 원하는 온도가 달성될 때까지 온도 변화 사이의 새로운 정상 상태 온도에서 최소 5분을 기다리며 설정점 온도를 5도 단위로 줄임으로써 이중층을 냉각시킵니다. 오일 목욕후 바이레이어를 원하는 최소 온도로 냉각한 후 GUI의 온도 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 온도 데이터와 시간 대 스프레드시트 소프트웨어를 내보냅니다.
현재 레코딩을 중지합니다. 측정된 전류로부터, 냉각 기간 동안 제곱파 전류 응답의 공칭 커패시턴스를 계산한다. 명목 커패시턴스와 온도를 플롯하여 멤브레인 커패시턴스가 어떻게 변했는지 관찰한 다음, 온도 대비 커패시턴스의 비단색 변화를 찾아 용융 온도를 식별합니다.
마찬가지로, 오일 목욕과 이중층 영역의 온도를 연속적으로 증가시킴으로써 고정 된 온도에서 이중 층의 준 정적 특정 커패시턴스를 평가합니다. GUI를 사용하여 섭씨 10도 단위로 설정점 온도를 변경하고 시스템이 새 온도에 평형화할 수 있도록 합니다. 이전에 설명한 단계를 수행하여 정전 용량 전류 및 기록 의 측정을 시작합니다.
마이크로 조작기의 위치를 신중하게 조정하여 이중 레이어 영역을 변경합니다. 제곱파 전류가 일정한 상태 진폭에 도달하고 DIB의 이미지를 수집하여 멤브레인 영역과 시간 대비 멤브레인 영역의 계산을 가능하게 합니다. 현미경에 장착된 카메라를 사용하여 조리개에서 볼 수 있는 바이레이어를 이미지화합니다.
동시에 현재 레코딩 소프트웨어에 디지털 태그를 추가하여 이미지 수집에 해당하는 시간 지점을 표시합니다. 총 5개의 DIB 이미지와 이중층 전류의 정상 상태 영역을 얻은 다음 온도를 재설정하고 이미징을 반복합니다. 현재 레코딩 및 DIB 이미지를 정상 상태 이중 레이어 영역에 대응하는 태그된 시간 지점에서 분석하고 각 온도에 대해 쌍층 커패시턴스 및 영역을 추출합니다.
각 온도에 대해 커패시턴스 대 영역을 플롯하고 각 온도에서 이중 레이어의 특정 커패시턴스를 나타내는 첫 번째 순서 회귀의 경사를 계산합니다. 그런 다음 특정 정전 용량과 해당 온도의 값을 플롯합니다. 비단색 변이에 대한 특정 커패시턴스와 온도 데이터를 검사하여 용융 온도를 식별합니다.
이중 계층에 걸쳐 DC 전압 스텝 입력을 생성하여 전압 의존 이온 채널 형성의 역학을 평가합니다. 초기 전압을 밀리볼트로 원하는 스텝 값으로 설정하고 최종 전압 및 스텝 크기를 원하는 단계보다 높은 값으로 설정합니다. 단계 입력에 대해 원하는 지속 시간을 몇 초 만에 설정한 다음 단계 입력에 대해 원하는 극성을 선택합니다.
패치 클램프 증폭기를 전환하여 실험실 뷰 또는 전압 출력 모듈에서 헤드 스테이지로 발생하는 명령 전압을 헤드 스테이지로 보내고, 전압을 켜고 유도된 전류 응답을 기록하여 중요한 전압에 대한 S자형 반응을 억제해야 합니다. 원하는 온도에서 멤브레인에 대한 동적 전류 전압 관계를 별도로 획득하여 이온 채널 동작과 같은 전압 의존관계를 드러냅니다. 파형 발생기에서 헤드 스테이지로 시작된 명령 전압을 헤드 스테이지로 전송하고 현재 레코딩을 시작하도록 패치 클램프 증폭기를 전환합니다.
파형 발생기에서 원하는 진폭, 오프셋 및 주파수로 연속 부비동 파형을 출력합니다. 유도된 전류 응답을 하나 또는 여러 사이클에 걸쳐 기록하고 다른 죄파 진폭, 주파수 및 온도에 대해 원하는 대로 반복합니다. 온도 조절 시스템은 뇌 총 지질 추출물 또는 BTLE, 지질으로부터 형성된 DIB의 온도 의존성을 보여주기 위해 사용되었다.
정전 용량 전류 및 온도 대 시간의 측정은 실온에서 약 60 °C까지 가열 사이클 동안 표시됩니다. 60°C에서 초기 이중층 형성 후 완전한 냉각/가열 사이클에 걸쳐 명목 커패시턴스와 온도의 변화가 문서화되었습니다. 다른 온도에서 특정 정전 용량의 준 정적 측정을 사용하여 지질 용융 온도를 식별할 수 있습니다.
이중 레이어 대 이중 레이어 영역의 커패시션을 플로팅하면 경사가 특정 커패시턴스의 값을 나타내는 선형 회귀를 허용합니다. DIB 이미지는 온도가 용융 온도 보다 낮을 때, 멤브레인이 잘 분리된 전극으로 인한 연탄 방울의 장력 하에서도 매우 접착제 상태를 채택한다는 것을 보여줍니다. 표시된 전류 대 전압 추적은 부비동막 전압을 적용하여 얻어졌으며, 유도전류를 두 개의 다른 온도에서 측정하였다.
화살표와 후속 숫자는 시간에 대한 부비동 압도 전압의 연속 분기를 시각화하는 데 도움이됩니다. 동일한 전압 수준에서 모나조마이신 도핑 BTLE 멤브레인에 대한 측정 된 전류 밀도와 두 개의 다른 온도가 여기에 표시됩니다. 육사데케인 오일을 알루미늄 설비의 우물에 올바르게 분배하는 것이 중요합니다.
순서가 순서대로 수행되지 않거나 신중하게 수행되면 기포가 아크릴 아래에 잘 형성되어 DIB의 상향식 시야를 방해합니다. 또한 사용자는 전체 기록을 보장하기 위해 각 측정 전에 온도 제어 소프트웨어의 데이터 버퍼를 지우는 것을 기억해야 합니다. 이 절차는 멤브레인 구조 및 수송의 온도 의존성을 연구하는 데 필요한 다양한 온도에서 생체 모방 막을 특성화 할 수 있습니다.
또한, 이 기능은 생물학적 이온 채널 및 엔지니어링 나노 물질과 같은 다른 막 활성 종의 나노 스케일 효과를 드러내는 데 사용될 수 있다.
