이 방법은 약물 전달, 생물학적 표적 검출 및 바이오 분리와 같은 분야에서 응용 이면이 있는 생체 분자 활성화 표면을 준비하는 데 사용될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 폴리 PFPA 브러시가 아민으로 반응성이 높고, 항체의 고정화가 몇 시간 동안 완충액의 배양에 의해 달성된다는 것입니다. 이 기술의 의미는 고정된 항체가 표적 항원과 성공적으로 결합할 수 있기 때문에 면역 정화를 통해 단백질 정제를 향해 확장됩니다.
이 방법은 항체 동원 및 단백질 정화를 위해 입증되지만, 생체 분자 동원을 요구하는 다른 시스템에도 적용될 수 있다. APTES로 이산화규소 구슬을 처리하려면 먼저 5%의 중량 부피 수성 현탁액의 형태로 이산화규입자를 얻습니다. 0.8 밀리리터의 이산화소및 40밀리그램의 APTES, 8밀리리터의 메탄올을 교반 바가 장착된 20밀리리터 신자극 바이알에 결합합니다.
격렬한 교반으로 5 시간 동안 실온에서 반응을 진행할 수 있습니다. 5시간 후 솔루션을 원문 튜브로 전송합니다. APTES 기능성 실리콘 이산화규구슬을 분리하려면 용액을 10, 000 G에서 5분간 원심분리합니다.
그런 다음 상체를 제거합니다. 이제 신선한 메탄올 의 세 밀리리터에 그들을 다시 박차하여 구슬을 씻어. 혼합을 위해 손으로 튜브를 흔들어만 필요한 경우 몇 초 동안 수조에서 초음파 처리로 분산을 개선하십시오.
원심 분리기는 이전과 같이, 한 번 더 세척 단계를 반복합니다. 메탄올 세척 이산화실리콘 구슬을 디메틸 설프리산화물 3밀리리터 또는 DMSO와 결합합니다. 혼합물을 손으로 흔들거나 필요한 경우 비드가 DMSO에 완전히 분산될 때까지 몇 초 동안 초음파 처리합니다.
이전의 원심 분리에 따라 상체를 제거하십시오. 원심분리 단계를 마지막 시간으로 반복하여 메탄올에서 DMSO로의 완전한 용매 교환을 보장합니다. 폴리 PFPA 용액을 준비하려면 20 밀리리터 신자극유리병에 2밀리리터의 DMSO 2밀리리터에 폴리 PFPA 20밀리그램을 녹입니다.
PEG 솔루션을 준비하려면 AMSO의 1밀리리터에 아민 기능화된 PEG를 용해하십시오. 이제 PEG 솔루션을 폴리 PFPA 솔루션으로 전송합니다. 격렬한 교반으로 실온에서 1 시간 동안 반응하십시오.
DMSO에서 중단된 APTES 기능성 실리콘 이산화규꺼비 1밀리리터를 PEG 대체 폴리 PFPA 용액으로 옮킨다. 폴리 PFPA와 APTES 기능화 실리콘 이산화규물 구슬 사이의 이식이 격렬한 교반으로 실온에서 1시간 동안 진행되도록 합니다. 그런 다음 구슬을 원심분리로 5분간 10, 000G로 분리한 다음 상퍼를 제거합니다.
비드 3밀리리터를 추가하여 씻어내고, 손으로 또는 몇 초의 초음파 처리로 섞는다. 구슬을 이전과 같이 원심 분리합니다. 그리고 DMSO 세척을 두 번 반복하기 전에 상체를 제거하십시오.
3밀리리터의 3밀리리터로 구슬을 두 번 더 씻으시다. 그런 다음 손으로 또는 초음파 처리의 몇 초와 혼합. 구슬을 이전과 같이 원심분리하고 상체부를 제거합니다.
마지막으로 밤새 진공 오븐에서 40도에서 구슬을 건조시. 폴리 PFPA 이식 실리콘 이산화규구5밀리그램을 1.5밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에 추가합니다. PBS의 800 마이크로 리터를 추가하여 구슬을 씻고, 소용돌이에 의해 잘 섞습니다.
1 분 동안 실온에서 10, 000 G에서 구슬을 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 세워 단계를 세 번 반복합니다. 이제 신선한 PBS 350 마이크로리터, 0.1%PBST의 50마이크로리터, 항체의 6.67 마이크로그램을 추가합니다.
섭씨 4도에서 회전에 약 20 시간 배양. 다음 날, 구슬과 원심분리기를 400G, 섭씨 4도에서 1분간 씻습니다. 그런 다음 상체를 제거하고 조심스럽게 400 개의 리시스 버퍼를 추가합니다.
구슬을 5번 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 재연합니다. 이 워시 단계를 세 번 반복하십시오. 마지막 세척 후, 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 셀 및 리시스 버퍼를 준비합니다. 그런 다음 리시스 버퍼의 400 마이크로 리터로 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 초음파 초음파 처리기로 세포를 초음파 처리합니다.
초음파 처리 후, 소용돌이가 간단히. 그런 다음 10 분 동안 섭씨 4도에서 20, 000 G에서 lysate을 원심 분리합니다. 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 상체를 옮기.
면역 침전을 수행하기 위해, 이전에 준비된 항체 고정 폴리 PFPA 이식 된 실리콘 이산화구슬로 세포 용액 300 마이크로 리터를 전송합니다. 새로운 마이크로센심분리기 튜브에 입력 샘플로서 세포 리세이트 30마이크로리터를 유지한다. 용액 구슬 혼합물을 섭씨 4도의 회전기에서 3시간 동안 배양합니다.
인큐베이션에 따라 혼합물을 섭씨 400G에서 1분간 원심분리합니다. 상체를 제거하고 400 마이크로리터의 세척 버퍼를 조심스럽게 추가하십시오. 구슬을 약 5회 위아래로 피펫으로 부드럽게 재보선다.
세 번의 세정 후에 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오. 구슬과 입력 샘플에 2x SDS 로딩 염료30 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 95도에서 10 분 동안 가열합니다.
가열 후, 서쪽 블로팅을 사용하여 샘플을 분석하거나 샘플을 영하 20도에서 저장합니다. 기능화된 실리카 구슬은 표면 조성물을 결정하기 위해 엑스레이 광전자 분광법 또는 XPS에 의해 검사됩니다. 대표적인 XPS 데이터는 여기에 표시됩니다.
APTES 처리 후, 아민 군 영역 APTES와 관련된 질소 1s 피크가 검출된다. 폴리 PFPA 처리에 이어, 폴리머의 PFP 유닛과 관련된 불소 1s 피크가 검출된다. 단백질 키나아제 RNA 활성화, 또는 면역 침전을 통한 PKR 농축이 수행되고, 발성 단백질 샘플은 서양 블로팅을 사용하여 분석된다.
예상대로, 항체가 없는 비구슬, 또는 비특이적 항체 혼합은 PKR 회수를 나타내지 않는다. 안티 PKR로 인큐베이션된 구슬은 PKR 밴드의 존재와 GAPDH 밴드의 부재로 표시된 대로 PKR을 성공적으로 풍부하게 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 시스템을 비교할 때 IP 실험과 후속 서부 블로팅 분석을 동시에 수행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.
개발 후, 이 기술은 상이한 생체 분자 또는 물질 기판의 고정화를 위해 사용될 수 있다. 또한 이 메서드는 각 응용 프로그램의 요구에 맞게 조정할 수 있는 표면 속성만 튜닝하는 추가이 있습니다.
