이 방법은 특수 장비를 필요로하지 않는 간단하고 저렴한 방법을 사용하여 다른 세포 유형의 세포 독성 활성을 비교하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 유해 물질의 사용을 필요로하지 않으며, 저렴하며 특수 장비의 사용을 요구하지 않는다는 것입니다. 이 방법은 CD8 플러스 세포 세포 세포와 같은 다른 세포 유형의 세포 독성 활성을 측정하거나 세포 활성 효과 세포없이 인큐베이팅없이 세포의 자발적 인사를 평가하기 위해 적용 될 수 있습니다.
이 기술에 새로운 개별은 가능성이 이펙터 세포 비율에 표적의 최적화와 투쟁할 것입니다. 내 조언은 프로토콜을 최적화 할 때 테스트 할 비율을 결정하기 위해 문학의 철저한 검색을 수행하는 것입니다. 이 방법은 피펫팅 을 정확하게 하는 것 이외에 전문적인 기술이 필요하지 않지만, 단일핵 세포의 분리및 분석판의 설정은 시각적으로 관찰될 경우 쉽게 이해하고 모방할 수 있는 단계이다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 첼시 Jekelley가 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 100 마이크로미터 필터가 들어있는 페트리 접시에 1.5 밀리리터의 FBS에 13.5 밀리리터의 RPMI를 추가하십시오. 필터에 태반 1개를 놓고 주사기 플런서의 평평한 면을 사용하여 필터를 통과하여 페트리 접시에 넣습니다.
다음으로, 각 조직에 대해 3개의 15 밀리리터 원내관을 설치했습니다. 각 튜브에 밀도 그라데이션 배지 3밀리리터를 추가하고 각 튜브에 균질화된 태반 5밀리리터를 천천히 오버레이합니다. 300배 G의 원심분리기와 실온에서 25분 간 휴식을 취하십시오.
그런 다음, 얇은 흰색 버피 층을 수집하기 위해 전송 파이펫을 사용합니다. 결합된 버피 레이어에 10밀리리터의 RPMI를 추가합니다. 원심분리기는 300배, 섭씨 4도에서 10분간 폐기하고 상주합니다.
첫째, 얼음 차가운 PBS의 50 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 비오틴 라벨 CD3 항체를 추가하고 파이펫과 잘 섞습니다. 튜브를 튜브 회전에 넣고 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다.
다음으로 RPMI 1 밀리리터를 추가합니다. 원심분리기는 G 400배, 섭씨 4도에서 10분 간. 상체를 버리고 RPMI의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
1.5 밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에 마그네틱 비드 150 마이크로리터와 셀 서스펜션을 결합합니다. 튜브를 튜브 회전기로 옮기고 섭씨 4도에서 30분 동안 배양하면서 회전합니다. 인큐베이션 중에 방출 버퍼를 회수하고 생체 안전 캐비닛에서 실온에 도달하게 하십시오.
인큐베이션이 완료되면 튜브를 자석에 1분 동안 놓습니다. 상체를 수집하고 얼음에 15 밀리리터 튜브에 CD3 부정적인 세포 인구를 저장합니다. 자석에서 튜브를 제거하고 RPMI1 밀리리터를 추가하고 파이펫을 사용하여 셀과 구슬을 5번 섞습니다.
그런 다음 튜브를 자석에 다시 1 분 동안 놓습니다. 상체를 수집하고 얼음에 15 밀리리터 튜브에 CD3 부정적인 인구를 저장합니다. 원심 분리는 CD3 음성 세포 집단을 400 배 G와 섭씨 4도에서 10 분 동안 분리합니다.
상체를 버리고 얼음 차가운 PBS의 50 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 그 후, 제조업체의 지침에 따라 비틴 라벨 CD161A 항체를 CD3 네거티브 세포에 추가하고 잘 섞는다. 튜브 회전에 튜브를 놓고 섭씨 4도에서 20분 동안 배양하십시오.
다음으로 RPMI와 원심분리기 1밀리리터를 G 400회, 섭씨 4도에서 10분 간 추가합니다. 상체를 버리고 RPMI의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 마그네틱 구슬과 결합하십시오. 튜브 회전기에 튜브를 놓고 30 분 동안 섭씨 4도에서 배양하는 동안 회전하십시오.
그런 다음 튜브를 자석에 1 분 동안 놓습니다. 상체를 수집하고 CD3 음의 CD161A 음세포를 폐기한다. 자석에서 튜브를 제거하고 RPMI 1 밀리리터를 추가하고 잘 섞습니다.
1 분 동안 자석에 튜브를 놓고, 상체를 수집하고 CD3 음성 CD161A 음의 세포를 폐기해야합니다. 그 후 자석에서 튜브를 제거하고 실온 방출 버퍼 1 밀리리터를 추가합니다. 튜브 회전기위에 튜브를 놓고 실온에서 15분 동안 배양하면서 회전합니다.
다음으로 튜브를 자석에 1분간 놓습니다. 얼음 위에 새로운 15 밀리리터 원피스 튜브에서 상체를 수집합니다. 자석에서 튜브를 제거하고 실온 RPMI1 밀리리터를 추가하고 잘 섞습니다.
튜브를 자석 아래에 1분 동안 다시 놓고 동일한 15밀리리터 원뿔 튜브에 상체를 수집하십시오. 잘 섞고 세포를 계산하기 위해 20 마이크로 리터 샘플을 복용하십시오. 세포를 400배, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.
상체를 제거하고 RPMI에서 세포를 다시 일시 중단합니다. NK 세포 활성화 매체의 2.5 밀리리터에서 잘 당 300, 000 세포의 농도로 6개의 우물 판으로 세포를 시드한다. 48시간 동안 가습된 인큐베이터에서 이산화탄소 5%를 37도에서 배양합니다.
후드에서, 얼음에 50 밀리리터 튜브에 매체에 YAC1 세포를 전송하고 잘 혼합하는 세로지학적 파이펫을 사용합니다. 20 마이크로 리터 알리쿼트세포를 사용하여 셀을 계산합니다. 세포를 300회 G와 섭씨 4도에서 10분간 회전시합니다.
세로지학적 파이펫을 사용하여, 15 밀리리터 원내 튜브에서 이전에 준비된 NK 셀 6웰 플레이트로부터 상체를 수집한다. 그런 다음 트립신 EDTA를 각 웰에 추가합니다. 접시를 탭하고 섭씨 37도에서 인큐베이터에 놓습니다.
세포가 트립신 EDTA로 약 5 분 동안 배양 한 후 멸균 플레이트 스크레이퍼를 사용하여 플레이트를 긁어 냅니다. 그런 다음 각 웰에 NK 셀 미디어의 1 밀리리터를 추가합니다. 혈청 피펫을 사용하여 세포와 미디어를 수집하고 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기십시오.
20 마이크로 리터 알리쿼트세포를 사용하여 셀을 계산합니다. NK 세포를 400배, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 첫째, 둥근 바닥을 얻고, 문화처리 96 웰 플레이트와 테이블 텍스트 프로토콜 중 하나에 설명 된 대로 설정합니다.
분석 플레이트를 4분 동안 250배 G로 원심분리하여 이펙터 및 표적 세포가 접촉하고 있는지 확인한다. 다음으로, 5시간 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도의 가습 챔버에서 플레이트를 배양합니다. 수퍼네이츠를 수확하기 45분 전에, 표적 셀 최대 LDH 방출 우물에 10X 리시스 용액의 10 마이크로리터를 추가하고 플레이트를 가습 챔버로 되돌려 놓습니다.
인큐베이션이 완료되면 4분 동안 250배 G의 플레이트를 원심분리한 다음 멀티 채널 파이퍼를 사용하여 50마이크로리터 알리코터를 모든 웰에서 신선한 96웰의 평평한 바닥 분석 플레이트로 옮긴다. 분석 플레이트의 각 웰에 50 마이크로 리터의 분석 시약을 추가합니다. 접시를 호일로 덮어 가볍고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
그 후 각 웰에 50마이크로리터의 스톱 솔루션을 추가합니다. 정지 용액을 추가한 후 1시간 이내에 플레이트를 읽고 흡광도를 490나노미터로 기록하십시오. NP와 RUPP 쥐로부터 얻은 태반 NK 세포는 50:1의 비율로 각각의 매체에 표적 세포로 5시간 동안 배양된다.
490 나노미터에 기록된 원시 흡광도 데이터는 여기에 나와 있다. 문화적 중간 배경과 볼륨 보정 제어 우물의 평균 흡광도가 계산되며, 이러한 평균은 제조업체의 프로토콜에 표시된 적절한 우물에서 빼는다. 수정된 값은 제조업체에서 제공하는 프로토콜을 사용하여 세포 독성을 얻는 데 사용됩니다.
이 방법은 피펫팅 을 정확하게 하는 것 이외에 전문적인 기술이 필요하지 않지만, 단일핵 세포의 분리및 분석판의 설정은 시각적으로 관찰될 경우 쉽게 이해하고 모방할 수 있는 단계이다. NK 세포의 격리 후, 임신 중 트로포블라스트 이주에 기인하는 태반 NK 세포의 역할을 결정하기 위한 공동 배양 실험과 같은 다수의 다른 절차가 수행될 수 있다. 우리는 또한 확장 된 NK 세포에서 미디어를 수집하여 분화 된 세포로부터 분비된 사이토 키나아제를 평가합니다.
고립 된 세포의 순도 또한 유동 세포 측정을 통해 평가 될 수있다.
