이 기술은 우리가 더 임상적으로 관련있는 조건하에서 항생제 감수성을 측정할 수 있습니다. 기술은 또한 우리가 골재에 있는 박테리아를 죽일 수 있는 진정한 항생 사격을 결정할 수 있습니다. 이 기술은 GC 집계를 제거하는 데 필요한 농도를 결정하는 데 적용 될 수있다.
이 방법은 또한 골재를 형성할 수 있는 임의의 박테리아의 항균 감수성을 측정하는 데 적용될 수 있다. lysis가 완료되었는지 확인하기 위해 lysis 단계에주의하십시오. 그렇지 않으면 ATP 측정 분석은 실행 가능한 박테리아의 수를 과소 평가합니다.
이 방법의 시각화를 통해 다른 연구자들이 이 실험을 일관성있게 따르고 복제할 수 있습니다. 먼저 GCK 한천에서 1%켈로그로그를 1%켈로그로1%로 보충한 나이세리아 임질 또는 GC 균주를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 줄이도록 합니다. 다음 날 아침, 가벼운 현미경을 사용하여 어두운 가장자리나 각 판의 어두운 가장자리가있는 필리 양성 식민지가없는 필리 음성 식민지를 신중하게 선택하고 수확 한 식민지를 새로운 GCK 플레이트에 줄여 섭씨 37도및 이산화탄소 5 %에서 16 ~ 18 시간 문화를 제공합니다.
다음 날 아침, 멸균 어플리케이터를 사용하여 각 플레이트에서 GC 콜로니를 수집하고 4.2 %의 중탄산 나트륨과 1 % 켈로그 용액으로 보충 된 따뜻한 국물에 각 면봉을 다시 중단하십시오. 650 나노미터 또는 OD650의 광학 밀도를 측정하여, 중단된 박테리아의 농도를 결정하고 밀리리터당 8개의 콜로니 형성 단위로 약 10배까지 GC 농도를 조절한다. 다음으로, GC 서스펜션의 마이크로리터를 96웰 플레이트의 개별 우물에 추가하고 박테리아가 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 6시간 동안 집계할 수 있도록 합니다.
인큐베이션이 끝나면, 각 우물에 연속적으로 희석된 세프트리악손 의 마이크로리터 1개를 추가하여 컨트롤역할을 하고 플레이트를 인큐베이터로 24시간 더 되돌려 놓습니다. 다음 날, 초음파 처리당 5초 동안 144와트, 20킬로헤르츠에서 각각 3회 현탁액을 초음파 처리하고 100마이크로리터의 ATP 활용 글로우 시약을 각 웰에 추가합니다. 각 우물에서 150 마이크로리터의 혼합물을 새로운 96웰 블랙 마이크로플레이트의 개별 우물로 조심스럽게 옮기고 플레이트 판독기에서 560 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다.
이어서, 연쇄 항생제 치료 후 얻어진 판독값의 비율로 생존율을 계산하여 치료되지 않은 우물에서 판독한다. 라이브/데드 GC 응재의 시각화를 위해 멸균 어플리케이터를 사용하여 하룻밤 배양 플레이트에서 GC를 수집하고 1%켈로그로그로 보충된 사전 동포 GCP 배지에서 GC를 재보습하십시오. 분광광법에 의한 OD650을 측정하고 밀리리터당 7개의 콜로니 형성 단위로 약 10배로 농도를 조절한다.
다음으로, GC 서스펜션 198마이크로리터를 8웰 커버슬립 바닥 챔버에 추가하고 챔버를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 6시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 응집 조건 당 세프 트리 악손의 두 마이크로 리터로 박테리아를 치료하고 적절한 실험 배양 기간 동안 인큐베이터에 챔버를 반환. 인큐베이션이 끝나면 0.6 마이크로리터의 라이브/데드 스테닝 용액을 각 우물에 넣고 챔버를 인큐베이터로 20분 더 돌려보도록 한다.
그런 다음 공초점 현미경을 사용하여 z 시리즈 이미지를 얻습니다. GC 집계 크기를 측정하려면 ImageJ에서 첫 번째 이미지를 열고 프리핸드 라인을 선택하여 이미지의 각 집계 영역을 동그라미로 조정합니다. 분석 및 측정을 클릭합니다.
집계 크기는 영역 열 아래에 표시됩니다. 각 골재에서 죽은 염색에 대한 라이브의 형광 강도 비율을 정량화하려면 측정을 분석하고 설정하고 팝업 창에서 통합 밀도를 확인합니다. 확인을 클릭하고 이미지, 색상 및 채널 도구를 클릭합니다.
죽은 박테리아 염색에 대한 형광으로 색상과 채널 하나를 선택합니다. 프리핸드 라인을 선택하여 각 집계 영역을 동그라미화하고 분석 및 측정을 클릭하여 통합 밀도 컬럼의 각 집계에 대한 형광 강도 비율을 얻습니다. 살아있는 세균 염색을 위한 형광을 위한 채널 2를 선택하고 다만 입증된 것처럼 각 골재에 있는 형광 강도를 측정합니다.
그런 다음 살아있는 형광 강도 데이터를 죽은 형광 강도 데이터로 나누어 죽은 형광 강도 비에 대한 살아있는 것을 얻습니다. 이 대표적인 실험에서, 비집계 된 pili 양성, 집계 된 필리 양성 또는 집계 및 중단 된 필리 양성 박테리아는 ATP 수준을 측정하기 전에 ceftriaxone의 직렬 희석으로 치료되었다. 사전 집계된 GC는 세프트리악손 이상의 동등한 농도로 치료할 때 GC를 방해한 비집계 또는 집계보다 훨씬 높은 생존을 입증하였다.
더 큰 골재를 형성하는 Pili 양성 균주는 돌연변이 균주에 비해 세프트리악손 치료 후 가장 높은 ATP 수준을 나타냈다. 에 관계없이 변형 테스트, 항생제 치료 전에 살아있는 / 죽은 염색은 주로 문화의 외부 층에 위치한 죽은 박테리아를 밝혀, 라이브 GC는 주로 ceftriaxone 처리 집계의 핵심 내에서 확인 된 동안. 예상대로, 필리 양성 박테리아는 가장 큰 골재를 형성하고, 필리 음성 배양은 가장 작게 형성되었다.
특히, pili 양성 골재는 항생제 치료 후 핵심 층에서 여전히 살아 있었고, 작고 느슨한 돌연변이 골재의 GC는 죽었습니다. GC의 크기와 생존에 기초하여, 상관 관계 그래프는 박테리아의 응집 크기와 항생제 생존 사이의 관계를 검사하기 위해 플롯 될 수있다. 초음파 처리는 각 개별 박테리아의 ATP가 단단히 결합된 골체 내에서 방출되는지 확인하는 데 중요합니다.
그렇지 않으면 측정이 일관성이 없습니다. 박테리아를 집계한 후 박테리아를 플레이트화하고 항생제로 치료하여 실행 가능한 박테리아와 복제 능력이 있는 박테리아를 모두 측정하는 것이 중요합니다. 이 기술은 박테리아 응집 영향을 항생제 감수성에 영향을 측정하여 연구원이 질병 치료에 더 나은 약물을 개발할 수 있도록 합니다.
