미토콘드리아 변화는 인간 난소암에서 중요한 역할을 합니다. 이 프로토콜은 인간 난소암및 대규모 프로테오믹스 분석을 위한 통제 조직으로부터 미토콘드리아를 분리하고 정화하는 효과적인 플랫폼을 확립한다. 미토콘드리아는 에너지 대사, 세포 신호 및 산화 스트레스의 중심지로서 난소암의 미토콘드리아 프로테오메 변화에 대한 통찰력은 우리의 이해 분자 메커니즘에 도움이 되며 효과적인 바이오마커및 치료 표적을 발견합니다.
이 기술은 밀도 그라데이션 원심분리와 함께 차분 속도 원심분리를 사용하여 제어 조직에서 인간 난소암과 미토콘드리아를 분리하여 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 고품질 미토콘드리아 샘플을 생성합니다. iTRAQ 정량 프로테오믹스와 결합된 미토콘드리아 제제는 다른 조직인 미토콘드리아 프로테오믹스를 쉽게 분석하는 인간 난소암 조직의 분석에 성공적으로 사용되었습니다. 이 방법을 수행 한 적이없는 사람들은 암 조직보다 난소 제어에서 미토콘드리아를 분리하는 것이 어려울 수 있음을 발견 할 수 있습니다.
그것은 제어 조직 균질화를 개선하고 미토 콘 드리아 분리를 개선하기 위해 밀도 그라데이션 배지의 여분의 층을 추가하기 위해 트립신을 추가 할 필요가있다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 미토콘드리아 격리 버퍼의 250 밀리리터를 준비합니다. 깨끗한 유리 접시에 약 1.5 그램의 난소암 조직을 놓습니다.
미리 차가운 미토콘드리아 절연 버퍼 2밀리리터를 추가하여 조직 표면에서 혈액을 가볍게 씻어줍니다. 이 세척을 세 번 반복합니다. 그런 다음 깨끗한 안과 가위를 사용하여 조직을 약 1 입방 밀리미터의 조각으로 완전히 다진 다음 다진 조직을 50 밀리리터 원심분리관으로 옮기습니다.
밀리리터당 0.2 밀리그램의 농도로 나구를 함유한 미토콘드리아 절연 버퍼 13.5 밀리리터를 추가합니다. 전자 균질화제를 사용하여 다진 조직을 섭씨 4도에서 2분 동안 균질화합니다. 그 후, 조직균질에 미토콘드리아 절연 버퍼의 또 다른 3 밀리리터를 추가하고 파이펫팅하여 잘 섞는다.
원심 분리기 준비 된 조직 은 1, 300 xg, 그리고 섭씨 4도에서 10 분 동안 균모합니다. 펠릿을 제거하고 상체를 유지합니다. 다음으로, 상류체는 10, 000 xg, 섭씨 4도에서 10분 동안 상류체를 원심분리합니다.
미세한 함유 상체를 제거하고 펠릿을 유지합니다. 미토콘드리아 절연 버퍼 2 밀리리터를 추가하고 가벼운 파이펫팅으로 펠릿을 철저히 중단합니다. 원심 분리기 7, 000 xg 및 섭씨 4도에서 10 분 동안이 펠릿 서스펜션.
상체를 버리고, 조잡한 미토콘드리아가 들어있는 펠릿을 보관하십시오. 추출된 원유 미토콘드리아를 다시 중단하기 위해 25% 밀도 그라데이션 배지의 12 밀리리터를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다시 중단된 원유 미토콘드리아를 포함하는 불연속 밀도 그라데이션을 만들고, 원심분리기는 52, 000xg, 그리고 섭씨 4도에서 90분 동안 만듭니다.
길고 무딘 주사기를 사용하여 25%와 30%의 그라데이션 배지 사이의 인터페이스에서 정제된 미토콘드리아를 수집하고 이를 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 수집된 미토콘드리아에 미토콘드리아 절연 버퍼를 추가하여 3배 부피로 희석합니다. 15, 000 xg의 원심 분리기, 섭씨 4도에서 20 분 동안.
상체를 버리고 펠릿을 보관하십시오. 정제된 미토콘드리아가 들어있는 최종 펠릿을 수집하고 섭씨 20도에 보관하십시오. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 미토콘드리아 절연 버퍼250밀리리터를 준비합니다.
깨끗한 유리 접시에 일반 제어 난소 조직의 약 1.5 그램을 추가합니다. 미리 차가운 미토콘드리아 절연 버퍼 2밀리리터를 추가하여 조직 표면에서 혈액을 가볍게 씻어줍니다. 이 세척을 세 번 반복합니다.
깨끗한 안과 가위를 사용하여 조직을 약 1입방 밀리미터의 조각으로 완전히 다진 다음 다진 조직을 깨끗한 50 밀리리터 튜브로 옮기습니다. 0.05%의 트립신과 20 밀리몰러 EDTA 및 PBS를 함유한 용액의 8밀리리터를 다진 대조조직에 추가하고, 실온에서 30분 동안 소화하여 세포를 분해하고 미토콘드리아를 방출합니다. 5 분 동안 200 xg에서 원심 분리기.
상체를 버리고 조직과 세포를 유지합니다. 밀리리터당 0.2밀리그램의 농도로 나구를 함유한 미토콘드리아 절연 완충제 13.5밀리리터를 추가하고, 전기 균질화제를 사용하여 다진 조직을 섭씨 4도에서 균질화합니다. 미토콘드리아 절연 버퍼의 또 다른 3 밀리리터를 조직에 균질화하고 파이펫팅하여 완전히 섞는다.
원심 분리준비 된 조직 은 1, 300 xg 및 섭씨 4도에서 10 분 동안 동종합니다. 펠릿을 제거하고 상체를 유지합니다. 10, 000 xg및 섭씨 4도에서 10 분 동안 상피 원심 분리합니다.
미성수체가 포함된 상체를 제거하고 펠릿을 유지합니다. 그런 다음 미토콘드리아 절연 버퍼 2 밀리리터를 추가하고 가벼운 파이펫팅으로 펠릿을 철저히 중단합니다. 원심 분리기 7, 000 xg 및 섭씨 4도에서 10 분 동안이 펠릿 서스펜션.
상체를 버리고 조잡한 미토콘드리아가 들어있는 펠릿을 보관하십시오. 추출된 원유 미토콘드리아를 다시 중단하기 위해 25% 밀도 그라데이션 배지의 12 밀리리터를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 미토콘드리아조를 함유한 불연속 밀도 그라데이션을 만들고, 원심분리기는 52, 000xg, 섭씨 4도에서 90분 동안 만듭니다.
길고 무딘 주사기를 사용하여 25~30% 그라데이션 배지 사이의 인터페이스에서 34~38%의 그라데이션 배지 사이의 인터페이스까지 다양한 범위에서 정제된 미토콘드리아를 수집한다. 정제된 미토콘드리아를 깨끗한 튜브로 옮는다. 수집된 미토콘드리아에 미토콘드리아 절연 버퍼를 추가하여 3배 부피로 희석합니다.
15, 000 xg및 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심 분리기를 폐기하고 상류부를 폐기하십시오. 미토콘드리아 절연 버퍼 2밀리리터를 추가하여 펠릿과 원심분리기를 15, 000 xg, 섭씨 4도에서 20분 동안 다시 중단합니다. 상체를 버리고 펠릿을 유지합니다.
최종 펠릿을 수집하고 섭씨 20도에 보관하십시오. 이 연구에서는, 고품질 미토콘드리아 견본은 인간 난소암 및 대규모 정량성 proteomics를 위한 통제 조직에서 제조됩니다. 난소암 조직으로부터 미토콘드리아의 제조에 몇 가지 차이가 있으며, 다른 불연속 밀도 그라데이션을 사용하는 것을 포함하여 난소 조직을 제어합니다.
원심분리 후 난소암 조직으로부터정제된 미토콘드리아는 25%에서 30%사이의 계면에서 발견되는 반면, 제어난소 조직에서 온 사람들은 25%와 30%사이의 계면에서 34%와 38%사이의 인터페이스에서 발견되는 반면, 제조된 미토콘드리아의 품질은 그 때 다른 미세 중구 및 원각성 심근으로 평가된다. 전자 현미경 이미지는 난소암과 통제 난소 조직에서, 고립된 주요 세포기관이 소량의 peroxisomes를 제외하고 미토콘드리아임을 보여줍니다. 그러나, 미토콘드리아의 형태는 난소 조직을 통제하기 보다는 난소암에서 더 많은 것을 바꾸기 위하여 보입니다.
준비된 미토콘드리아의 품질은 또한 서쪽 얼룩을 통해 평가됩니다. 서부 블롯 이미지는 또한 난소암및 제어 난소에서 제조된 미토콘드리아 샘플의 주요 성분이 전자 현미경 분석과 일치하는 소량의 peroxisomes를 제외하고는 미토콘드리아임을 보여줍니다. 미토콘드리아가 퍼록시좀과 광범위하게 상호 작용하기 때문에 퍼록시솜이 제조된 미토콘드리아에 함유되는 것이 합리적이며, 이는 미토콘드리아의 기능적 완전성을 반영한다.
이러한 결과는 준비된 미토콘드리아 샘플의 고품질을 보여줍니다. 이 절차를 수행할 때 균질화 하기 전에 조직을 완전히 다진 하 고 다진 제어 조직에 트립신을 추가하는 것이 매우 중요합니다. 또한 암 샘플 및 대조군을 위해 불연속 밀도 그라데이션을 만들고 제조하는 것도 중요합니다.
이 절차에 따라 iTRAQ 또는 TMT 정량성 프로테오믹스 또는 인포프로테오믹스는 난소암 미토콘드리아 프로테오메 프로파일을 명확히 하기 위해 수행될 수 있으며, 인포프로테오메 프로파일은 난소암에서 미토콘드리아의 역할을 큰 깊이에서 명확히 하기 위해 확립될 수 있다. 이 기술은 연구원이 체계적으로 난소암에서 미토콘드리아 proteome및 인포프로테오메를 연구하고, 신호 경로 네트워크 시스템을 구축하고, 신뢰할 수 있는 바이오마커및 치료 표적을 발견하는 길을 열어줍니다.
