이 프로토콜은 이온화 방사선이 종양 세포 모집에 어떻게 영향을 미치는지 분석하기 위하여 이용되고 추가 개발될 수 있습니다, 암 재발의 더 중대한 이해로 이끌어 내는. 유방 오르가노이드는 강력한 모델입니다. 그들은 생체 내 특성의 기본을 모방하지만 생물학적 변수를 쉽게 분리 할 수 있습니다.
저유착판의 사용은 단백질 행렬과 관련된 작업 흐름 문제를 무효화합니다. 삼중 음성 유방암 환자는 치료 다음 높은 비율로 지역 재발을 경험합니다. 방사선이 종양과 면역 세포 행동에 어떻게 영향을 미치는지 연구하면 재발 메커니즘에 대한 중요한 통찰력이 발생할 수 있습니다.
오르가노이드의 공초점 현미경 검사를 시연하는 것은 실버라 바티스타 연구소의 대학원생인 하비에르 고메즈입니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 희생된 마우스에서 복부 및 잉게인 유방 선지를 제거하는 이 절차를 시작합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 시료를 조사한 후 45분 후, 35mm 멸균 세포판에 매머 땀샘을 놓고 메스를 가진 다진다.
조직이 이완하고 지역에서 약 1 평방 밀리미터보다 크지 않은 조각을 얻을 때까지 약 40 스트로크를 가진 다진. 이제 50 밀리리터 원심분리기 튜브에서 콜라게나제 용액으로 조직을 전달합니다. 마우스당 콜라게나아제 용액 10밀리리터를 사용하십시오.
샘플 튜브를 30~60분간 섭씨 37도에 놓고 10분마다 5초 동안 소용돌이를 피합니다. 콜라게나아제 용액이 흐리면 소화가 완료됩니다. 소화된 용액을 450회-G에서 실온에서 10분간 회전시보시면 됩니다.
이제 세 개의 레이어가 관찰됩니다. 상체는 지방으로 구성되며, 중간 층은 수성 용액이며, 바닥은 펠릿이다. 펠릿은 상피 세포, 개별 기질 세포 및 적혈구의 혼합물이기 때문에 빨간색으로 나타납니다.
BSA 용액을 추가 및 제거하여 접촉하기 전에 BSA 솔루션으로 모든 파이펫, 파이펫 팁 및 원심분리기 튜브를 미리 코팅합니다. BSA 용액은 각 실험 전에 멸균 필터링해야하지만 재사용할 수 있습니다. 추가 복구를 위해 상체를 신선한 BSA 코팅 15 밀리리터 튜브로 옮길 수 있습니다.
피펫은 지방 층을 분산시키기 위해 힘차게 위아래로 합니다. 원심 분리는 실온에서 10 분 동안 450 배-G에서 샘플을 원심 분리합니다. 셀 펠릿을 흡입하지 않도록 튜브에 소량의 미디어를 남기며, 초퍼를 흡인한다.
이제 원래 펠릿으로 튜브에서 수성 층을 흡인합니다. 원래 펠릿으로 튜브에 DMEM/F12 10 밀리리터를 추가하고 두 번째 튜브로 옮습니다. 파이펫은 두 개의 펠릿을 결합하고 재중단하기 위해 적극적으로 결합합니다.
실온에서 10분 동안 450배-G에서 원심분리한 후, 슈퍼나탄을 흡인시키고 튜브에 DMEM/F12 4밀리리터를 추가합니다. 서스펜션에 40 마이크로리터를 넣고 실온에서 2~5분 동안 손으로 부드럽게 흔들어 줍니다. DMEM/F12의 6밀리리터와 파이펫을 철저히 추가합니다.
실온에서 10분 동안 450회-G에서 튜브를 원심분리한 후, 슈퍼너처를 0.5밀리리터 마크로 흡인시합니다. DMEM/F12의 10 밀리리터와 파이펫으로 펠릿을 완전히 재놓습니다. 이제 450회-G로 맥동하고 그 속도에 도달한 후 4초 간 정지하여 튜브를 원심분리합니다.
원심 분화를 통해 오르가노이드를 정화하기 위해 세정 단계를 세 번 더 반복하십시오. 펠릿은 이제 상피 오르가노이드로만 구성된 오프 화이트 컬러여야 합니다. DMEM/F12의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
파이펫을 철저히 만들어 균일한 용액을 만듭니다. 50 마이크로리터를 30mm 페트리 접시로 옮기고 20X의 위상 대비 현미경으로 볼 수 있습니다. 집계 카운터가 있는 오르가노이드 의 수를 계산합니다.
파이펫 50 마이크로리터의 오가노이드는 저접착 플레이트의 각 우물에 넣습니다. 150 마이크로리터의 오구노이드 배지를 추가하여 총 작업량을 200 마이크로리터에 넣습니다. 2일마다 배지를 조심스럽게 교체하십시오.
DMEM 미디어에서 GFP 또는 D-토마토 라벨이 부착된 생 264.7대식세포를 10%FPS와 1%페니실린-연쇄 절제술으로 보충합니다. 원하는 밀도에서 세포를 오르가노이드 배지로 시드합니다. 라이브 세포 상 대비 및 형광 이미징을 사용하여 시간이 지남에 따라 대식세포 침투를 모니터링합니다.
조심스럽게 흡입하여 우물에서 오르간성 배지를 제거합니다. 실온에서 10% 중성 버퍼링 된 포르말린으로 샘플을 수정합니다. 고정 된 오르가노이드를 1X PBS에서 5 분 동안 세 번 씻으세요.
원하는 경우 고정 시료를 1주일 동안 섭씨 4도에 보관하여 염색할 수 있습니다. 세척 후 고정 된 오르가노이드를 5 분 동안 투약하십시오. PBS로 5분 동안 3회 세척하기 전에 실온에서 1시간 동안 0.1%PBST로 고정 된 오가노이드를 차단하십시오.
고정 된 오르가노이드를 항 사이토케라틴-14, E-cadherin 또는 단단한 접합 단백질 1개를 PBST에서 1%NGS로 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBST에서 5 분간 세 번 씻습니다. 이제 상온에서 1 시간 동안 1 %NGS PBST와 염소 안티 래빗 이차 항체와 오르가노이드를 배양.
광 노출을 피하기 위해 호일로 덮습니다. 이전과 같이 세척 한 후 핵염을 약 반 시간 동안 염색하기 위해 핵염을 사용하십시오. 스테인드 오르가노이드를 PBS에서 3회 5분간 씻습니다.
챔버 슬라이드를 사용하는 경우 커버 슬립으로 마운트하십시오. 최대 2 주 동안 섭씨 4도에 호일에 싸여 오르가노이드를 저장합니다. 조사된 오르가노이드는 저접착 플레이트 또는 지하 막 내에서 배양될 수 있지만, 가장 빠른 성장은 저유착판에서 발생하였다.
오르가노이드는 유방 선특성을 재구성했습니다. 덕트 및 로브와 형태학적으로 유사한 구조가 관찰되었다. 성장 동향은 오르가노이드가 소화 및 정렬 후 즉시 시드되었을 때, 비 조사 된 오르가노이드가 DNA 손상 수리 메커니즘으로 인한 세포 성장 체포로 인해 조사 된 오르가노이드보다 빠르게 성장했다고 지적했습니다.
오르가노이드는 면역 형광 염색을 통해 평가된 상피 특성을 발현했습니다. 조사된 오르가노이드는 상피 마커를 발현했습니다. 심근의 마커인 세포근-14는 조사된 오르가노이드의 표면에 강하게 표현되었다.
또한, E-cadherin 및 단단한 접합 단백질 하나는 오르가노이드의 세포 접합 부당 내에서 발현되었다. 이 단백질은 적당한 세포 접착을 위해 필수적입니다. 조사 후, 오르가노이드는 그들의 상피 특성을 계속 유지했습니다.
유기체의 형광 염색은 형광 현미경 검사를 사용하여 저접착 판 내에서 시각화 될 수 있습니다. 그러나, 가장 명확한 시각화는 공초점 현미경 검사를 통해 얻어졌다. 보정된 총 형광 강도는 배경을 빼고 오르가노이드 부위에 의해 정상화함으로써 계산되었다.
96웰저접착 플레이트에서 성장하는 오르가노이드도 공동 배양 실험을 단순화하였다. 유방 선에서 전형적인 농도에서 씨를 뿌린 경우, 대식 세포 화는 조사 된 오르가노이드로 증가했습니다. 이 절차를 수행 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 오르가노이드를 과도하게 소화하지 않고 원심 분화를 적절하게 정화하는 것입니다.
이 절차에 따라 추가 공동 배양 실험을 수행할 수 있습니다. 오르가노이드는 종양 세포, 다른 면역 세포 및 기질 세포와 함께 배양되어 재발과 관련된 조사 된 미세 환경을 재현 할 수 있습니다. 이 방법은 정상적인 조직 손상이 특히 면역 세포 역학에 미치는 영향을 평가하는 데 중요하며 결국 종양 세포 모집 메커니즘을 이해하는 데 사용될 것입니다.
유방 오르가노이드는 유방 선 발달의 해명 기계장치를 가지고 있고, 시험관에서 강하게 유방암을 재수량했습니다. 우리는 우리의 모형이 방사선 유도한 종양 세포 모집에 관하여 통찰력을 제공하기를 바랍니다.
