이 프로토콜은 우리가 베타 세포와 같은 인간 조직에서 내인성 mitophagy 복합체를 모니터링 할 수 있습니다, 중추적 인 번역 관련 조직에서 mitophagy 연구를 촉진. 이 기술의 한 가지 장점은 희귀 한 가용성 또는 작은 샘플 숫자로 조직에서 생체 내에서 중요한 미노파기 복합체를 시각화하는 능력입니다. 표준 프로토콜에 따라 격리 된 후, 문화권은 섭씨 37도에서 적어도 하루 동안 완전한 췌장 섬 배지의 10 밀리리터에서 세 번째 인간 섬에 4 ~ 6 번 10 배 등가합니다.
다음 날, 배율 내에서 개별 인간 섬을 계산하기 위해 세 배율에서 해부 빛 현미경을 사용합니다. 치료 당 40 개의 섬 또는 관심 상태 1.5 밀리리터 튜브 의 섬 매체를 선택하십시오. 퇴적물 원심분리에 의해 섬과 50 마이크로 몰라 PR619로 보충 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단.
튜브를 반전시키고 원심분리로 섬을 수집하여 신선한 PBS와 듀비퀴티나아제 억제제로 두 번째 세척을 합니다. 두 번째 원심 분리 후, 섬들을 125마이크로리터0.25%의 미량리터와 37도에서 3분간 억제제로 분리하여 주기적인 부드러운 파이펫팅을 한다. 인큐베이션이 끝나면 PR619로 보충된 섭씨 37도의 온난한 췌장 암막 매체의 1밀리리터로 반응을 체포한다.
신선한 PBS플러스 세척당 억제제에서 두 개의 세척에 원심분리하여 섬을 수집합니다. 두 번째 세척 후, 신선한 PBS 플러스 억제제의 150 마이크로 리터에 해리 된 섬을 다시 중단. 개별 섬의 준수 및 고정을 위해 세포 용액을 서리가 내린 충전 현미경 슬라이드에 고정하고 소수성 펜으로 세포 영역을 간략하게 설명합니다.
그런 다음 동봉된 세포를 4%의 파라포름알데히드 및 PBS로 실온에서 15분 동안 수정합니다. 아슬레 샘플의 면역히토화학적 분석을 위해 실온에서 PBS에서 5분 세척 2개로 세포를 세척하고, 실온에서 10%의 당나귀 혈청과 PBS를 1시간 동안 0.3%의 세제로 비특이적 결합 차단을 한다. 차단 인큐베이션의 끝에서, 유비퀴틴 특이적 펩티다아제 8, 호성 조절체 수용체 분해 단백질-1에 대한 1차 토끼 항체, 마우스 나 토끼에서 제기되지 않은 베타 세포 식별에 대한 마커를 사용하여 세포를 4도에서 하룻밤 동안 근접 결집 분석 신호를 방해하지 않도록 하여 세포를 주화한다.
다음 아침, 로커에 PBS에서 두 5 분 세척으로 샘플을 씻어. 갓 준비된 근접 계합 분석 용액에 염소 Cy5 이차 항체를 첨가합니다. 두 번째 세척 후 각 섬각 섬 샘플을 프로브 용액 20 마이크로리터로 라벨을 붙이고 플라스틱 필름으로 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.
인큐베이션이 끝나면 로커에 버퍼 A에 2개의 5분 세척으로 세포를 씻은 다음 새로 준비된 리기션 용액 20마이크로리터를 37도에서 30분 동안 슬라이드당 리구비저 당 0.25 단위로 보충하여 배양합니다. 결찰이 끝나면 완충 A로 셀을 2회 세척할 수 있습니다. 각 샘플을 섭씨 37도에서 100-120분 동안 폴리머라제로 보충한 20마이크로리터의 증폭 용액으로 각 샘플을 덮습니다.
이미징을 위해 세포를 준비하려면 로커에서 세척당 10분 동안 신선한 버퍼 A로 샘플을 두 번 세척한 다음 로커에서 2분간 0.1x 버퍼 B로 1회 세척합니다. 마지막 세척 후, DAPI가 들어있는 마운팅 매체한방울로 슬라이드를 장착하고 메스를 사용하여 각 샘플에 커버슬립을 조심스럽게 놓아 거품을 내밀어 놓습니다. 그런 다음 가장자리 주위에 명확한 매니큐어로 커버립을 밀봉합니다.
샘플을 이미지화하려면 여러 초점 평면을 캡처할 수 있는 현미경의 단계에 슬라이드를 배치하고 100배 배율을 선택합니다. Z 스택 높이를 약 0.45 마이크로미터및 적절한 얼룩, 카운터스테인 및 라이브 셀 신호 여기 및 방출 매개 변수로 설정합니다. 적어도 9개의 서로 다른 초점 평면 이미지를 가져옵니다.
형광 이미지 배경 신호와 길 잃은 빛을 최소화하기 위해 표준 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 2차원 분광에 가까운 이웃 알고리즘을 활용하여 이미지를 처리합니다. 근접 계합 분석 상호 작용을 정량화하려면 ImageJ를 열고 근접 계합 분석 이미지를 엽니다. 첫 번째 급격한 초점 이미지에서 시작하여 이미지를 클릭하고 조정 및 임계값을 선택합니다.
임계값을 조정하여 비특이적 근접 계합 분석 신호를 모두 제거하고 분석 전반에 걸쳐 신호를 일관되게 유지하려고 임계값 조정을 기록합니다. 프로세스를 클릭하고 바이너리를 선택하고 바이너리를 만듭니다. 크기가 무한대로 0으로 설정되어 있는지 확인하고, 순환은 0대 1로 설정되어, 표시가 윤곽선으로 설정되어 표시 결과 및 결과 클리어 상자를 확인합니다.
샘플 및 Z 스택 위치를 나타내는 스프레드시트에서 분석된 파티클 수를 기록합니다. 그런 다음 파티클 분석 및 분석을 클릭하여 파티클을 측정합니다. 샘플에 대한 모든 초점 Z 스택을 분석한 경우 스프레드시트에서 샘플의 총 입자 수를 보내 총 상호 작용 수를 정량화합니다.
근접 분석에서 사용되는 항체는 리간드에 특이하며 중복을 나타내지 않는다. 관찰된 바와 같이, 분산 프로토콜은 다운스트림 분석을 위한 현미경 분야에서 단일 세포를 획득하는 데 매우 효율적이며 베타 세포 염색은 1차 인간 섬에서 근접 결찰 분석 염색에 따라 유지된다. 입증된 기술을 이용하여, 중성조절체 분해 단백질-1 및 유비퀴틴 특이적 펩티다아제 8의 상호작용이 팔미타테에 48시간 노출된 후 감소되는 것을 확인할 수 있으며, 당뇨병 유발 성 자극에 따른 주요 내인성 미소상학 요인을 평가하기 위한 이 분석의 타당성을 강조한다.
인간 섬의 효율적이고 부드러운 분산은 올바른 세포 집단하류의 정량화를 보장하는 데 필수적입니다. PLA는 인간 적인 가정 견본에 있는 중요한 mitophagy 복합체의 평가를 앞으로 당뇨병 연구의 필드를 이동하는 mitophagy 및 생물학으로 중요한 인간 적인 참을성 있는 환자 견본의 분석을 허용합니다.
