이 프로토콜은 고효율siRNA를 전달하여 생체 내에서 유전자를 침묵할 수 있는 나노 입자 시스템의 합성을 설명합니다. 단순히 표적 펩티드와 siRNA 페이로드를 교환함으로써, fusogenic 나노 입자는 생체 내 유전자 변조를 요구하는 질병에 대한 잠재적 인 치료 제제로 사용될 수있다. 우리는 이전에 만성 염증을 종료하기 위해 대식세포에서 염증을 인코딩하는 유전자를 침묵시킴으로써 그람 양성 세균 감염에 대한 후생 나노 플랫폼을 사용하여 결과를 발표했습니다.
이 절차를 수행하기 전에 실리콘 웨이퍼를 포함하는 Teflon 에칭 세포를 3 대 1 하이드로 플루오릭 산 용액에 조립하십시오. 0.6초 동안 곱타임당 50밀리미터의 낮은 전류 밀도와 500사이클 동안 반복되는 0.36초 동안 센티미터당 400밀리암퍼의 높은 전류 밀도로 사각 파형의 번갈아 전류를 실행합니다. 에칭이 완료되면 회로에서 세포를 제거하고 주사기를 사용하여 수력 불소성 용액을 조심스럽게 헹구습니다.
그런 다음 에탄올로 세 번 헹구습니다. 실리콘 웨이퍼에서 다공성 층을 들어 올리기 위해 먼저 1-29 개의 수력 불소산 용액의 10 밀리리터로 에칭 세포의 우물을 채웁니다. 그런 다음 250초 동안 3.7밀리미터의 일정한 분과곱을 실행합니다.
에칭이 끝나면 회로에서 셀을 제거합니다. 다공성 실리콘 층은 결정성 실리콘 웨이퍼로부터 분리를 나타내는 눈에 보이는 잔물결을 가질 수 있다. 수력 불소성 용액을 부드럽게 씻어 내고 에탄올과 물로 각각 3 배 헹구십시오.
파이펫 팁을 사용하여 다공성 실리콘 층의 둘레를 단단히 부수고 완전한 분리를 합니다. 에탄올을 사용하여 테플론 에칭 셀에서 계량 보트로 다공성 실리콘 조각 또는 칩을 수집합니다. 그런 다음, 저장을 위해 유리 유리 바이알에 칩을 전송합니다.
다음으로 다공성 실리콘 칩을 함유한 유리 바이알의 에탄올을 RNase 가 없는 물의 2밀리리터로 교체한다. 파라필름을 사용하여 유리병을 단단히 캡하고 밀봉하십시오. 유리 유리알을 초음파 식기 욕조에 넣고 다공성 실리콘 칩의 부피가 수조 표면 아래에 완전히 침수될 정도로 중단됩니다.
초음파 처리 중 상당한 물 손실을 방지하기 위해 플라스크의 개구부가 수조의 표면에 닿도록 물로 채워진 볼륨 플라스크를 놓습니다. 그런 다음 48와트의 RF 전력으로 35 킬로헤르츠에서 다공성 실리콘 칩을 12 시간 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 유리 유리 바이알을 평평한 표면에 1 시간 동안 배치하여 큰 입자가 바닥에 정착 할 수 있도록합니다.
그런 다음 파이펫을 사용하여 상체를 수집합니다. 유리 바이알에 DMPC 용액 72.55 마이크로리터, DSPE-PEG 용액 15.16 마이크로리터, DOTAP 용액 19.63 마이크로리터를 추가하고 파이펫팅으로 혼합합니다. 용매가 하룻밤 동안 증발 할 수 있도록 느슨한 캡연기 후드에 유리병을 배치합니다.
말린 필름은 유리병 의 바닥에 흐린, 하드, 젤 같은 물질이 될 것입니다. 다음으로, 이전에 준비된 아이스 초음파 처리 욕조에 150 마이크로리터의 다공성 실리콘 나노 입자를 포함하는 마이크로 센심 분리기 튜브를 배치합니다. 15분 간의 초음파 처리 하에, 시RNA 150 마이크로리터와 염화물 2개의 미디온 700마이크로리터를 다공성 실리콘 나노입자에 부드럽게 피펫합니다.
초음파 처리기에서 siRNA로드 칼슘 코팅 다공 성 실리콘 나노 입자의 1 밀리리터를 포함하는 튜브를 제거합니다. 넓은 비커를 탈온화된 물로 채웁니다. 폴리카보네이트 멤브레인과 4개의 필터를 수면에 띄워 보세요.
그런 다음 제조업체의 지시에 따라 리포솜 압출 키트를 조립합니다. 다음으로, siRNA 로딩된 칼슘 코팅 다공성 실리콘 나노입자의 1밀리리터로 유리 유리병에 말린 지질 필름을 수화한다. 모든 지질이 바이알 의 바닥에서 들어 올릴 때까지 파이펫과 흐린, 균일 한 용액이 관찰될 때까지.
유리 유리 바이알에 마그네틱 교반 바를 추가하고 유리 판에 유리병을 놓고 입자를 섭씨 40도까지 가열하고 용액을 자기적으로 20 분 동안 교반합니다. 이에 따라 압출기의 한쪽에 빈 주사기를 부착합니다. 그런 다음, 지질 코팅 다공성 실리콘 나노 입자 용액의 1 밀리리터로 다른 주사기를 채우고, 압출기의 반대편에 주사기를 부착한다.
피스톤을 천천히 밀어 내고, 한 주사기에서, 폴리카보네이트 멤브레인을 통과하고, 다른 주사기로 입자를 밀어 넣음으로써 압출을 시작합니다. 20번 반복합니다. 그런 다음 압출된 입자를 미세 원심 분리튜브로 수집합니다.
RNase 가 없는 물에 밀리리터 당 1 밀리그램 펩티드 농도로 펩티드 스톡을 준비합니다. 후생 지질 코팅 다공성 실리콘 나노 입자를 포함하는 마이크로 원심 분리기 튜브에서 펩티드 스톡의 마이크로리터 100 마이크로리터와 파이펫을 부드럽게 추가합니다. 튜브를 실온에서 20분 동안 정전기상태로 유지합니다.
과도한 펩타이드 또는 siRNA 및 기타 부형제를 제거하려면 실온에서 1시간 동안 5, 000회 g에서 회전하여 30킬로달톤 원심 필터로 세척하십시오. 원심 분리기는 동일한 설정에서 PBS의 1 밀리리터로 두 번 더. 원심분리에 따라, 최종 펩타이드-컨쥬게이드 후공지질 코팅 다공성 실리콘 나노입자를 원하는 농도로 PBS에서 재연한다.
입자는 적어도 30 일 동안 영하 80도에서 알리인용및 저장될 수 있습니다. fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 성공적인 합성은 구조적 변화를 일으키지 않고 30 일 동안 저장되고 해동 될 수있는 균일하고 약간 불투명한 용액을 생성해야합니다. 비율 및 농도를 최적화하지 못하면 반복되는 동결 해동 주기뿐만 아니라 적재 시 집계될 수 있습니다.
입자가 압출됨에 따라 동적 광 산란에 의해 측정된 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 평균 유체 역학 직경은 약 200 나노미터여야 하며 평균 제타 전위는 약 7 밀리볼트가 되어야 한다. 표적화 펩티드를 사용하여 표면 변형 후 전체 직경은 230 나노미터 미만이어야하며 평균 제타 전위가 마이너스 3.4 밀리볼트로 감소합니다. 융합은 심포성 플루오로포레 DiI와 후생지질을 표시하고 공초점 현미경을 사용하여 체외 국소화를 관찰함으로써 확인될 수 있다.
성공적인 융합은 후생성 다공성 실리콘 나노입자의 지질이 DiI를 플라즈마 멤브레인으로 옮기고 리소좀과 독립적으로 국한화될 때 관찰된다. 실패한 융합은 세포의 세포질 내의 DiI 국소화및 리소좀과의 공동 국소화를 보여줄 것이다. 이 fusogenic 나노 입자 시스템은 지금 세균성 감염 뿐 아니라 암 보조 치료 및 암 면역 요법에서 치료 응용을 위해 사용되고 있습니다.
이 프로토콜은 siRNA 보다 더 많은 로드에 더욱 최적화될 수 있습니다. fusogenic 나노 입자 시스템은 mRNAs 및 CRISPR/Cas9 복합체와 같은 더 큰 성전환 페이로드를 적재하고 전달할 수 있는 잠재력을 보여주었습니다.
