뇌에 전달 된 NGF는 도전적이다. 여기서 우리는 생리 활성 단백질의 안전하고 장기간 방출을 허용하는 새로운 유형의 담체를 제시합니다. 이 기술을 통해 NGF를 다공성 실리콘 캐리어에 간단하고 효율적으로 로드할 수 있습니다.
그것은 실온에서 강한 유기 용매를 사용하지 않고 수행됩니다. 다공성 실리콘 캐리어 설계가 조정될 수 있기 때문에 캐리어는 장기 방출을 위한 NGF 저수지 임플란트역할을 할 수 있지만 다른 요인 및 약물을 운반하도록 수정될 수도 있다. 엔지니어와 화학자의 경우 제조 공정을 수행하기가 더 쉬울 수 있습니다.
생명 과학자와 임상의를 위해, 세포 배양 절차는 재현하기 위하여 상대적으로 간단해야 합니다. 알루미늄 호일 스트립을 이용하여 폴리테트라플루로 에탈린 에칭 셀에 잘 특징지어진 1점 5센트 실리콘 웨이퍼를 백 컨택으로 장착하고 세포를 밀봉하는 o-링으로 시작한다. 직물은 매번 유사한 저항 값을 가진 실리콘 웨이퍼를 사용하기 위해 저항 할 수 있습니다.
전기화학적으로 250 밀리미터의 일정한 전류 밀도에서 20초 동안 아크레우스 수력불산 및 에탄올의 3~1용액으로 실리콘 샘플을 제곱량250밀리미터곱곱에 식히도록 에칭한다. 그런 다음 질소 스트림 하에서 건조하기 전에 에탄올로 생성된 다공성 실리콘 필름의 표면을 세 번 헹구십시오. 시료가 건조하면, 튜브 용광로에 새로 새겨진 다공성 실리콘 샘플을 주변 공기에서 1시간 동안 섭씨 800도에서 열적으로 식히면 산화된 다공성 실리콘 스캐폴드를 형성한다.
샘플이 냉각되면 다이싱 톱을 사용하여 8mm 의 샘플로 자른다. NGF로 샘플을 로드하려면 각 샘플 위에 새로 준비된 NGF 로딩 솔루션 52마이크로리터를 분배하고 습도가 높은 조건하에서 덮인 접시에 실온에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 2시간 후, 샘플 위에 용액을 수집하고 NGF 로딩 솔루션과 수집된 후 로딩 솔루션 샘플을 일리자 키트에 적합한 농도 범위로 희석한다.
모든 시료가 희석되면, NGF 포획 항체96웰 일리자 플레이트의 각 웰에 교정 곡선 샘플에 희석된 시료의 100마이크로리터를 실온에서 2시간 동안 배양한다. 인큐베이션이 끝나면 플레이트를 4번 세척하고 실온에서 2시간 동안 각 웰에 생체 세틸화 검출 항체의 밀리리터 당 100 마이크로리터를 첨가한다. 4개의 세척 후, 입증된 바와 같이, 실온에서 30분 동안 각 우물에 아비딘-고추냉이 페록시다이스의 100마이크로리터를 추가하고, 4개의 세척 완충제가 세차합니다.
마지막 세척 후, 실온에서 25 분 색상 발달 인큐베이션을 위해 각 우물에 100 마이크로 리터의 기판 용액을 추가하십시오. 그런 다음 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 650나노미터로 설정된 파장 보정으로 405 나노미터에서 흡광도를 측정하고 교정 곡선을 기반으로 로딩 솔루션과 수집된 포스트 로딩 솔루션 모두에서 NGF 농도를 결정한다. Vitro NGF 릴리스의 경우, NGF로드 산화 다공성 실리콘 캐리어를 0 점 제로 1 의 2 밀리리터에 1 % 보이바인 혈청 알바만으로 보충하여 섭씨 37도에서 2 % 나트륨 아지드와 궤도 접면분당 100 회전을 보충합니다.
매 번 2일마다 솔루션을 수집하여 각 포부 후 신선한 PBS 2밀리리터로 교체하십시오. 그런 다음 방금 입증된 대로 iliza에 의한 NGF 분석전까지 액체 질소에서 수집된 방출 샘플을 영하 20도 저장으로 동결합니다. 분화페오 크로모 시토마(12) 또는 PC(12)를 생성하기 위해, 세포 배양, 센트리푸징에 의한 세포 현탁액을 수집하고 신선한 기본 성장 배지의 5밀리리터로 세포를 다시 일시 중단한다.
두 번째 sentribugation 후, 기본 성장 배지의 3 밀리리터에서 미각을 다시 중단하고 23 게이지 주사기를 사용하여 세포를 10번 흡인하여 모든 세포 클러스터를 분리한다. 계산 후, 1회 10번 종자 10~4세포의 제곱근 작업 영역은 콜리겐 타입의 1코팅플레이트에 분화 배지가 존재한다. 접시를 인큐베이터에 놓습니다.
섭씨 37도에서 24시간 후 신선한 뮤린 베타 NGF 또는 NGF장전다공성 실리콘 캐리어를 각 플레이트에 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 세포 생존가능성을 평가하기 위해, 37°C에서 5시간 동안 대표 시간지점에서 적절한 생존지표 용액의 10%를 배양하고, 630나노미터로 설정된 파장 보정으로 490나노미터의 스펙트럼을 측정한다. NGF 장전다공성 실리콘 캐리어의 존재시 PC 12 세포 분화를 평가하기 위해, PC 12 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 12개의 낮은 콜라겐 코팅 플레이트에 시드하고 이전에 획득한 시험관 내 방출 샘플을 적절한 실험용 우물에 소개한다.
24 시간 잠복 후, 가벼운 현미경 검사법에 의해 세포를 이미지하 고 수동으로 각 우물에 알 크로나 우리테스를 가진 세포의 수를 계산합니다. 분화PC(12)세포의 모프로메트릭 분석을 위해 NGF로 치료후 최대 3일간 배양된 세포의 상 영상을 획득하고 뉴런 J.Convert에서 파일을 열어 이미지 파일을 8비트 형식으로 변환하고 이미지 스케일 바를 사용하여 픽셀 대 마이크로미터 비율을 측정한다. 스케일을 설정하고 각 중성염의 길이를 측정하려면 분석 및 설정 스케일을 사용합니다.
그런 다음 수동으로 분기 점의 수와 각 세포 소마에서 유래하는 nourites수를 계산합니다. 생성된 산화 다공성 실리콘 필름의 고해상도 스캐닝 전자 현미경 이미지가 표시됩니다. 이 필름의 최고 뷰 현미경 사진은 직경 약 40나노미터의 기공을 가진 고다공성 특성을 보여줍니다.
갈라진 필름의 단면 현미경 사진은 원통형 모공을 상호 연결하는 특징인 2점 9 마이크로미터의 다공성 층 두께를 나타낸다. 버스트 효과 없이 NGF의 지속적인 방출은 출시 기간 의 후반에 훨씬 느린 방출 속도에 비해 첫 주 동안 빠른 NGF 릴리스와 함께 한 달 동안 달성된다. NGF 장전다공성 실리콘 캐리어를 사용한 치료는 PC 12 세포 배양에서 특징적인 분기 뉴런 네트워크에서 중성염의 형성을 유도한다.
26일 후에도, 방출된 NGF는 다공성 숙주 내의 NGF 함정이 약 1개월 동안 단백질의 생물학적 활성을 보존한다는 것을 나타내는 50% 이상의 세포 분화를 유도한다. 1일과 3일에 NGF 하중 다공성 실리콘 처리세포 집단의 형태측정 분석은 NGF 로드다공실리콘으로 처리된 PC 12 세포가 시험된 세 가지 파라미터 모두에 대한 대조된 치료 배양에서 관찰된 것과 유사한 형태성 값을 나타낸다는 것을 보여준다. 제시된 단계를 적절히 따르고 이행하면 뉴런 세포의 생존과 분화를 유지할 수 있는 유리한 NGF 전달 시스템을 제공합니다.
우리는 현재 그들의 일반적인 보호 효력을 공부하고 알츠하이머 병과 같은 퇴행성 질병을 알고 있는 두뇌에 있는 임플란트를 장기적으로 풀어 놓는 으로 NGF 다공성 실리콘 운반대의 사용을 조사하고 있습니다. 이 절차에 따라, 도살 나무 회진 세포의 정상적인 성장에 대한 NGF장부하다공성 실리콘 캐리어의 효과도 연구될 수 있다. 다공성 실리콘은 광범위한 응용 분야에 활용할 수 있는 유망한 나노 물질입니다.
생물학적 또는 화학 센서, 진단 및 이미징을 포함하여 여기에 제시된 것 이외에. 다공성 실리콘 운반선의 잠재적 독성을 배제하려면 셀라인을 향해 절제성 에세이를 수행하고 다공성 실리콘 샘플을 살균하십시오.
