이 프로토콜은 총성 잔류물의 화학 성분을 감지하도록 설계된 독특한 바이오 센서의 준비 및 분석을 설명합니다. 법의학 응용 분야에 바이오 센서를 사용하는 것은 독특합니다. 일반적으로 법의학 실험실에서 사용되는 고도로 전문화된 계측에 대한 대안을 사용하기 간편하고 사용하기 간편합니다.
설명된 합성 생물학 방법은 표준 합성 생물학 부분을 사용하는 모든 시스템에 사용될 수 있습니다. 설명된 화학 분석은 적색 형광 단백질을 표현하는 모든 바이오 센서에 적용됩니다. 절차를 시연하는 것은 롱우드 대학의 학부 생인 안드레아 솔스와 엘 리차드슨이 될 것입니다.
이 절차를 시작하려면 이전에 격리 된 J10060 플라스미드 DNA의 10 마이크로 리터를 미세 원심 분리기 튜브에 추가하십시오. 8개의 마이크로리터의 물과 에코리와 NHEL 효소 각각의 마이크로리터 1개를 완충제 1마이크로리터와 미리 혼합합니다. 프로모터 DNA의 경우, 신선한 미세 원심 분리기 튜브에 아닐 프로모터 DNA 서열10마이크로리터를 추가합니다.
8개의 마이크로리터의 물과 에코리와 NHEL 효소 각각의 마이크로리터 1개를 완충제 1마이크로리터와 미리 혼합합니다. 10 마이크로리터로 설정된 파이펫을 사용하여 샘플을 위아래로 부드럽게 피펫하여 혼합합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.
그런 다음 효소를 섭씨 80도에서 5분간 가열하고 활성화합니다. 소화된 DNA를 냉동실에 보관하여 준비될 때까지 보관합니다. 먼저, 이전에 소화된 플라스미드 및 프로모터 DNA를 사용하여 텍스트 프로토콜 중 하나에 설명된 바와 같이 얼음에 미세트리퍼지 튜브에 반응을 설정합니다.
T4 DNA 리구아제 마지막을 추가해야 합니다. 파이펫을 위아래로 부드럽게 위아래로 작용하고 원심분리기를 짧게 섞습니다. 실온에서 10분 동안 배양하세요.
그런 다음 10 분 동안 65도에서 가열하고 활성화하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 변환을 수행합니다. 먼저 텍스트 프로토콜의 표 2에 설명된 대로 PCR에 대한 반응 혼합물을 설정합니다.
부드럽게 위아래로 파이펫하여 반응을 혼합합니다. 노란색 파이펫 팁을 사용하여 변형된 대장균의 식민지를 긁어냅니다. 이 대장균을 분리한 새로운 LB-암피실린 한고 판에 스 와이프한 다음 PCR 튜브에 파이펫 팁을 삽입합니다.
파이펫 팁을 흔들어 E.Coli와 PCR 믹스를 혼합합니다. 추가 식민지에 대한이 과정을 세 번 더 반복합니다. 그런 다음 PCR 튜브를 PCR 기계에 로드하고 텍스트 프로토콜의 표 3에 설명된 대로 써모사이클링을 시작합니다.
텍스트 프로토콜의 표 4에 설명된 대로 적절한 수의 멸균 배양 튜브에 레이블을 지정합니다. 각 튜브에 준비된 배양 국물의 2밀리리터를 추가합니다. 테이블 4에 설명된 대로 튜브에 애니라이트 스톡 솔루션을 추가합니다.
그런 다음 배양 튜브에 스냅 캡을 배치하여 튜브로 공기가 유입될 수 있도록 느슨해지도록 합니다. 각 배양 튜브를 소용돌이. 그 후, 튜브를 섭씨 37도, RPM 220에서 24시간 이상 흔들리는 인큐베이터에 넣습니다.
먼저, 손가락을 포함하여 손의 모든 표면을 닦아 리드를 제거하기 위해 설계된 에탄올 기반 의 닦기를 사용합니다. 분석할 때까지 적절하게 레이블이 부착된 밀봉 가능한 가방에 물티슈를 보관합니다. 시험할 큰 표면을 닦아 알코올 기반 닦아.
에탄올로 적신 면 스왑을 사용하여 테스트할 작은 표면을 닦아냅니다. 깨끗한 장갑을 착용하고 알코올로 청소 한 가위를 사용하여 닦아 중심에서 약 1 평방 센티미터인 부분을 잘라냅니다. 그런 다음, 절단된 물살 또는 면봉을 센서 박테리아의 2밀리리터를 포함하는 배양 튜브에 직접 넣고 국물에 완전히 침수되도록 한다.
분광계를 준비하여 RFP 변종에 적합한 파장에서 형광 성출물을 수집하며, 500나노미터의 난동을 갖는다. 그런 다음 소용돌이 믹서를 사용하여 튜브를 흔들어 줍니다. 각 상체를 소량의 큐벳으로 조심스럽게 옮기고 배출 강도를 수집합니다.
소용돌이 믹서를 사용하여 튜브를 흔들어주세요. 국물의 200 마이크로리터를 우물판에 잘 옮기다. 이 플레이트의 각 우물에 어떤 샘플이 들어갔는지 기록합니다.
RFP 변종에 적합한 파장에서 방출 강도를 수집하기 위해 밀가루계를 설정합니다. 대표적인 RFP 변종에 대한 형광 스펙트럼은 추가된 두 개의 다른 수준의 음수 제어와 스펙트럼을 모두 나타낸다. 이 작업에 사용되는 RFP 변이체에 대한 최대 형광 신호는 575 나노미터에서 관찰된다.
대표적인 데이터는 휴대용 분광계와 불소계 모두에서 동일한 솔루션 집합에 대해 수집됩니다. 음광의 농도가 증가함에 따라 형광이 증가하는 일반적인 추세가 있다. 리드 센서의 경우 10억 개당 약 800개 이상의 고농도에서 이러한 고농도에서 납의 독성으로 인해 응답이 떨어진다는 점은 주목할 가치가 있다.
지출 된 40 구경 카트리지 케이스의 내부에서 에탄올 면봉 샘플의 분석은 원리 결과의 증거를 제공합니다. 세 가지 센서 박테리아 각각의 긍정적 인 결과는 총성 잔류물에 대한 긍정적 인 테스트를 나타냅니다. 이 프로토콜에 준비된 바이오 센서는 식품, 물 또는 환경 샘플의 오염을 감지하기 위해 개별적으로 사용할 수도 있습니다.
이 기술은 연구원이 다양한 화학 적 음염에 대한 표준 합성 생물학 기술을 사용하여 바이오 센서를 개발할 수있는 길을 열어줍니다. 개인 보호 장비를 착용해야 하며, 분석가들은 E.coli를 취급한 후 손을 씻고 표면을 소독해야 합니다. 폐기물은 자동화되어야 하며 중금속이 함유된 폐기물은 그에 따라 처리되어야 합니다.
