그것은 잘 많은 단백질의 구조는 공유 이황화물 연결에서 안정화되어 있음을 잘 확립하고있다. 최근 작업에서이 채권은 번역 후 수정으로 분류되었습니다. 따라서 빠르고 간단한 방법을 사용하여 살아있는 세포에서 시스테인 안정화 멀티머 복합체를 식별할 수 있어야 합니다.
이 기술의 주요 장점은 결과를 얻을 수 있고, 쉽고, 최소 비용으로 해석할 수 있다는 것입니다. 우선, 최소 필수 중간 고당감의 6평방센티미터 접시에 U-2 OS 세포를 성장시키고, 10%의 FBS와 1%나트륨 피루바테를 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도로 보충한다. 사용하기 직전에 10 밀리마일라 요오도아세타미드의 신선한 육수를 만드십시오.
세포가 50~60%에 도달하면 세포 배양 매체에 직접 0.1 밀리머 최종 농도 요오도아세타미드를 추가합니다. 실온에서 2분간 부드럽게 접시를 흔들어 주세요. 다음으로, 세포로부터 미디어를 흡인시키고, 차가운 PBS의 5밀리리터로 세포를 세 번 씻는다.
최종 PBS 세척 용액을 흡인하고 차가운 PBS 1 밀리리터를 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시 바닥에서 세포를 긁어냅니다. 1밀리리터 파이펫을 사용하여 PBS 및 셀 서스펜션을 작성하고 모든 액체를 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 분배합니다.
세포가 섭씨 4도에서 7, 500g에서 3분간 회전합니다. 세포 펠릿을 뒤로 하고 PBS를 흡입합니다. 세포 펠릿은 처리 될 때까지 영하 80도에서 저장할 수 있습니다.
단백질을 추출하려면 이중 증류수로 희석된 1X 리시스 버퍼의 100마이크로리터를 준비합니다. 1 밀리머 최종 농도에 사용하기 직전에 PMSF를 추가합니다. 그런 다음 1X 용해 버퍼의 50 마이크로리터를 셀 펠릿에 직접 추가하고 다시 중단합니다.
5 분 동안 얼음에 추출물을 배양. 일정한 펄스 모드를 사용하여 8초 동안 초음파 처리하여 40%의 속도로 추출물을 얼음 위에 유지합니다. 추출물을 섭씨 4도, 16, 000배에서 5분간 회전합니다.
원하는 경우 단백질 농도를 결정하기 위해 브래드포드 분석을 수행합니다. 시료를 준비하려면 수용성 단백질 추출물의 10 마이크로리터를 채취하고 1X Laemmli SDS 샘플 버퍼의 10 마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
젤을 실행하기 전에 샘플을 섭씨 85도에서 5분간 가열합니다. 포름알데히드 교차 연결을 시작하려면 175 평방 센티미터플라스크에서 U-2 OS 셀을 70 ~80%의 연결성으로 성장시다. 연기 후드에서 포름알데히드 고정을 중간에 직접 첨가하여 최종 농도가 1%로, 15분 동안 부드러운 교반으로 실온에서 배양합니다.
반응을 담금질하려면 1.25 개의 어금니 글리신을 최종 농도0.125 어금니에 추가하고 5 분 동안 로커에 부드러운 동요로 실온에서 배양하십시오. 차가운 PBS의 5 밀리리터로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. 최종 PBS 세척 용액을 흡인하고 PBS 10 밀리리터를 추가합니다.
셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크 바닥에서 세포를 긁어냅니다. 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 PBS 및 세포 현탁액을 끌어내고 모든 액체를 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 분배합니다. 셀을 500배, 섭씨 4도에서 2분간 회전합니다.
세포 펠릿을 뒤로 하고 PBS를 흡입합니다. pH 7.4에서 0.25 개의 어어 자당, 1 밀리머 EDTA, 10 밀리모어 HEPES 및 0.5 %BSA를 추가하여 균질화 버퍼의 10 밀리리터를 준비하십시오. 사용 직전에 PMSF를 1 밀리머 최종 농도와 3밀리리터의 핵 서스펜션 버퍼에 추가하십시오.
균질화 버퍼의 5 밀리리터를 세포 펠릿에 직접 넣고 완전히 다시 중단합니다. 서스펜션은 500배, 섭씨 4도에서 2분간 분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 버리고 균질화 완충제의 5 밀리리터로 펠릿을 다시 놓습니다.
그런 다음 타이트 한 피팅 유리 Teflon 균질화로 500 RPM 당 10 스트로크로 세포를 균질화하고 10 분 동안 1, 500 배 및 섭씨 4도에서 서스펜션을 원심 분리합니다. 원심 분리 후 상체를 폐기합니다. 핵 서스펜션 버퍼의 1밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고 10분 동안 얼음에 배양합니다.
인큐베이션 후 원심분리기는 10분 동안 600배 g로 원심분리기를 합니다. 원심분리 후, 상체를 버리고 핵 현탁액 버퍼및 원심분리기의 1밀리리터로 펠릿을 다시 보간한다. 최종 펠릿은 분리된 핵이 될 것이다.
1X 리시스 버퍼의 25 마이크로리터를 세포 펠릿에 직접 첨가하기 전에 설명된 바와 같이 단백질을 추출한다. 그런 다음 수용성 단백질 추출물 10마이크로리터를 복용하여 SDS PAGE에 대한 두 가지 샘플을 준비하고 2X Laemmli SDS 샘플 버퍼 10개와 BME 의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 1샘플을 섭씨 37도에서 5분간 가열하고 두 번째 샘플을 섭씨 98도에서 15분간 가열하여 포름알데히드 크로스 링크를 반전시합니다.
25 밀리머 트리, 192 밀리머 글리신및 부피 SD 당 0.1 %의 무게를 혼합하여 1X 트리스 글리신 실행 버퍼의 1 리터를 준비합니다. 그런 다음 SDS PAGE 실행 장치를 설정합니다. 제조업체의 프로토콜당 16%의 프리캐스트 TGX SDS-PAGE 패키지를 열고 카세트를 제거합니다. 카세트 의 바닥에서 우물과 테이프를 안감하는 빗을 제거하고 젤을 실행 장치에 넣습니다.
우물이 액체에 담길 때까지 챔버를 1X 실행 버퍼로 채웁니다. 플라스틱 파이펫을 사용하여 러닝 버퍼로 우물을 헹지 게 됩니다. 미리 스테인드 된 표준 마커의 10 마이크로 리터와 함께 샘플을 젤에 로드합니다.
마지막으로, 염료 전면이 젤 의 바닥에서 약 1 센티미터 가 될 때까지 200 볼트에서 젤을 실행합니다. BME 환원제의 부재에 있는 총 세포 추출물의 서쪽 얼룩 분석은 상이한 인간 세포 집단에 있는 다혈복합체 형성을 보여주었습니다. 복합체는 검사된 4개의 세포주 모두에 BME를 추가하여 사라졌으며, 이는 이황화물 연계의 존재를 나타냅니다.
수확 시 인간 세포에서 dUTPase의 단황 확인은 dUTPase의 동소 형태의 적어도 세 가지의 조합입니다: 미토콘드리아 동소형태, 핵 동위형태, M24에 지적된 잘린 버전. 대조군으로 사용되는 미토콘드리아 동소형은 이황화물 연계를 형성하지 않았고 단황 단백질에 대한 예측된 분자량으로 이동시켰다. 핵 dUTPase의 포름알데히드 교차 연결은 다원 복합 형성을 입증했다.
15분 동안 95도에서 샘플을 배양하여 교차 링크가 반전되었을 때, 복합체는 불안정하고 단색 상태로 시각화될 수 있었습니다. 요오도아세타미드를 추가하는 것은 이 절차에서 무료 시스테인 잔류물을 차단하고 이황화물 연계가 추출 절차의 결과가 아님을 확인하는 중요한 단계입니다. BME 또는 DDT와 같은 환원제를 SDS-PAGE 샘플에 추가하지 않는 것이 중요합니다.
