이 실험의 전반적인 목표, 우리의 뒷다리 허혈 모델은 실험이 putative 혈관 유발 제의 기능, 히스토아제 및 분자 효과에 대한 포괄적 인 평가를위한 기초를 조명하는 것입니다. 이 프로토콜은 임상 맥락에서 향후 적용 가능성을 가진 작은 동물 모델에서 가능한 혈관 신생 요법의 시험을 위한 표준을 필드. 재혈관화는 중요한 허혈 환자의 20~30%에 적합하지 않기 때문에 치료 혈관신생은 허혈성 부위의 혈액 풍부를 개선하기 위한 새로운 전략으로 부상하고 있다.
이 실험 프로토콜은 혈관 신생 요법이 각 결과에 대한 효능의 척도에서 효과를 발휘하는 메커니즘에 대한 포괄적 인 이해를 제공 할 수 있습니다. 22주 된 C57 블랙 6 여성 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 오른쪽 뒷다리에서 머리를 면도하고 가열 패드에 큐비투스 위치에 등쪽의 동물을 고정. 동물을 해부 현미경 으로 놓습니다.
그리고 오른쪽 뒷다리의 허벅지 에 1 센티미터 피부 절개를 만들기 위해 숫자 11 수술 메스 블레이드를 사용합니다. 무딘 신경 혈관 번들을 노출 피하 지방을 해부. 그리고 뾰족한 집게, 스프링 가위 및 안과 바늘 홀더를 사용하여 막막 에로피모페랄 칼집을 열어 말단 외부 장심 및 대퇴혈관을 노출시킵니다.
동맥과 정맥을 신경에서 해부하고 분리한 후 7O 비흡수성 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 해골 대퇴동맥과 정맥 및 말단 외부 장모 동맥 및 정맥을 리칭하십시오. 말단 외부 장악 동맥의 식별과 결찰 및 절단 은 단상 외부 장악 및 대퇴 동맥 및 정맥의 결찰 및 절제는 절차의 성공에 매우 중요합니다. 스프링 가위를 사용하여 실피성 동맥과 정맥의 부분을 탈구와 근위 매듭 사이에 분리합니다.
그리고 흡수 성 봉합사로 절개를 닫습니다. 그런 다음 복상 간 항용액을 동물에 전달하고 마우스를 전체 복구할 때까지 모니터링하여 홈 케이지로 반환합니다. 위장관 근육을 수확하려면 두 뒷다리에서 피부를 제거하십시오.
그리고 면봉을 사용하여 피부와 근육을 분리합니다. 아킬레스 건을 들고, 스프링 가위를 사용하여 경골과 비골에서 무릎 관절까지 근육을 분리하십시오. 그리고 이두근 페모리스를 위트롬혈근육과 분리한다.
스프링 가위를 사용하여 무릎 관절 수준에서 위장관 근육의 삽입을 자른다. 그리고 10%트리가산을 사용하여 수확한 근육을 작은 코르크 디스크의 횡방향에 배치합니다. 이어서, 액체 질소 냉각에 표본을 동결 하 고 영하 80도 저장에 대 한 opentane.
모세관 미세 절 레이저 캡처의 경우 근육 표본의 12 마이크로 미터 섹션을 얻은 후, 영하 20도에서 5 분 동안 냉각 된 순수 아세톤의 50 밀리리터에서 슬라이드에 조직을 고정합니다. 공기 건조 후 소수성 펜으로 각 시편을 동그라미. 그리고 PBS에서 염화 나트륨 2개를 섭씨 4도에서 재수화합니다.
재수분의 끝에서, 하룻밤 섭씨 4도에서 관심의 적절한 1 차 항체와 샘플을 라벨. 그 다음에 는 세척당 PBS에서 신선한 2개의 어금니 나트륨 염화나트륨으로 23분간 세척합니다. 두 번째 세척 후, 4섭씨에서 30분 동안 적절한 이차 항체로 섹션을 표시한 다음 PBS의 염화나트륨에 2개의 세척을 시연한다.
다음으로, 4섭씨에서 30분 동안 아비딘 컨쥬게이드 페록시다제 복합체로 샘플을 라벨로 붙인다. DAB peroxidase 기판으로 세척 및 5 분 라벨링이 뒤따릅니다. 인큐베이션이 끝나면 순차적 얼음 에서 조직을 탈수하여 90%에탄올과 100% 에탄올 에머지에서 탈수합니다.
이어서, 마우스당 10, 000개의 모세혈관을 해부하고 투석기당 10, 000개의 모세혈관을 마이크로후지 튜브 접착제 캡으로 해부하기 위해 355나노미터 레이저를 솔리드 상태로 펄스가 장착한 후 마이크로절시스템을 사용한다. 그림과 같이, 뒷다리 관류의 완전한 손실은 뒤다리 허혈 유도 후에 즉시 관찰됩니다. ISC와 NISC 사지의 비율로 표현된 혈류의 정량적 평가는 HLI 이후 15일과 45일에 친 혈관신생 자극에 노출된 마우스의 사지 혈액 관류가 현저하게 향상된 것으로 나타났다.
위장혈증 근육 조직 섹션의 조직학적 섹션에서 CD31 양성 모세혈관의 정량화는 모세관 밀도가 허혈성 대 비 허혈성 사지에서 더 크다는 것을 보여줍니다. 예상대로. 그러나 이 효력은 프로 혈관신생 에이전트를 가진 처리 후에 추가 증폭됩니다.
부수적인 혈관 밀도는 또한 허혈성 사지에 있는 일관되게 증가하고 이 증가는 친 혈관신생 자극을 가진 노출 후에 상당히 높습니다. CD31 양성 내피 세포에서 프로 혈관신생 유전자 발현의 역전사 중합체 연쇄 반응 분석은 프로 혈관신생 제에게 노출되거나 그렇지 않은 마우스 간의 유전자 발현의 명확한 변화를 보여준다. 혈관 해부 동안 동맥과 정맥의 찢어방지막 일리오페모랄 칼집을 열기 위해 더 오래된 안과 바늘을 사용하는 것이 중요합니다.
이 선박은 레이저 도플러 기반 의 관류 측정 및 모세관 혈관 밀도의 조직학적 정량화에 의해 용이하게 평가된 뒷다리 허혈에 반응하여 혈관 신생을 평가할 수 있게 한다.
