프로토콜은 단백질 결합 부위의 포화 돌연변이 발생에 사용됩니다. 단백질 결합 부위가 알려지지 않은 경우 이 프로토콜을 사용하여 식별할 수 있습니다. 이 기술은 질병 진단 및 치료에 대한 관련성을 가지고 있습니다.
나는 생물 의학 과학에 있는 그것의 잠재력이 완전히 착취될 남아 있다고 믿습니다. 이 방법은 원하는 분자가 바람직하지 않은 분자로부터 분리 될 수있는 단백질 이나 반응에 광범위하게 적용 될 수 있습니다. 라이브러리가 제대로 무작위화되었는지 확인하고 각 결합 및 분리 단계 동안 원하는 분자의 접이식 농축이 높은지 확인하십시오.
그것은 단어로 설명하기보다는 더 잘 입증 되는 몇 가지 단계와 많은 세부 사항을 포함한다. 이 비디오를 시청한 후에는 무작위 라이브러리를 준비하고, 시작 RNA 풀을 합성하고, 높은 친화력과 특정 바인더를 얻기 위해 원하는 분자와 원치 않는 분자를 분리하는 결합 반응을 수행하는 방법에 익숙해져야 합니다. 먼저, DNA 신디사이저상화학합성에 의한 전방 프라이머와 역프라이머를 합성한다.
또한 무작위 라이브러리 올리고뉴클레오티드 템플릿을 31개의 무작위 위치로 합성합니다. PCR 튜브에서, 하나의 마이크로 몰라 DNA 임의의 라이브러리 템플릿을 혼합, T7 RNA 폴리머라제 프로모터 및 리버스 프라이머를 함유한 1마이크로몰러 포워드 프라이머, pH 8에서 20밀리머 트리스, 염화 마그네슘 1.5밀리알륨, 염화칼륨 50밀리알륨, 밀리리터 아세트소 스루메닌 1마이크로그램, Tqa 20의 마이크로그램 을 함유하고 있습니다. 5주기의 디내튜레이션, 어닐링 및 확장 단계로 PCR 기계를 설정하고, 그 다음에 는 프로모터를 DNA 라이브러리에 부착하기 위한 확장의 한 주기가 뒤따릅니다.
T7 전사 완충, 1마이크로몰러 무작위 라이브러리 풀 DNA, 5밀리머 DTT, 2밀리머 GTP, 각각 ATP, CTP 및 UTP 1밀리머, 마이크로리터 T7 RNA 폴리머를 포함하는 100 마이크로리터 전사 반응을 설정합니다. 이제 아크릴 유리 방패와 장갑을 착용. 사인 방사선 촬영에 대한 전사 반응에 알파-32P UTP의 5 마이크로리터 이하를 추가하여 방사능을 소개합니다.
37°C에서 2시간 동안 마이크로센심심분리기 튜브에 반응 혼합물을 배양합니다. 젤 정제 RNA를 위해, 10%의 탈질 폴리아크라이알라미드 젤을 준비한다. 샘플을 젤 의 우물에 적재합니다.
젤을 엑스레이 필름에 노출시키고 젤의 녹취록의 위치를 식별하고 젤 슬라이스를 잘라냅니다. 원심분리기 튜브에 젤 슬라이스를 넣고 균질화 팁으로 작은 조각으로 나뉩습니다. 단백질Ae K 버퍼를 추가하여 젤 조각을 담그게 합니다.
실온에서 적어도 2 시간 동안 영양사에 튜브를 둡니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 고속 마이크로센심분리기에서 회전하여 젤 이물질을 제거하고 완충액을 회수합니다. 상류체, 소용돌이 및 원심분리기를 사용하여 동일한 양의 페놀 클로로폼을 튜브에 넣습니다.
페놀 클로로폼으로 추출을 한 번 더 반복한 다음 클로로폼으로 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 단백질아제 K 완충제의 수성 상과 pH 5.2, 10 마이크로그램의 tRNA 또는 20 마이크로그램의 글리코겐, 영하 20도에 저장된 에탄올 2~3권으로 3마리의 아세테이트 3음절을 혼합한다. 튜브를 영하 80도에서 1시간 동안 그대로 둡니다.
마이크로 센트심분리기에서 섭씨 4도에서 5~10분 동안 용액을 함유한 튜브를 회전시합니다. 상체를 조심스럽게 버리고 RNA 펠릿을 헹구기 위해 70%에탄올을 추가합니다. 2~5분간 회전합니다.
에탄올을 조심스럽게 흡입하고 RNA 펠릿을 공기 건조시한다. 다음으로, RNA 펠릿을 용해시키기 위해 DEPC로 처리된 50마이크로리터의 물을 추가합니다. 샘플을 섭씨 영하 20도까지 보관하십시오.
단백질과 RNA를 100마이크로리터의 반응부로 결합하려면, 먼저 pH 7.5에서 10밀리머 트리스 염화염을 50밀리머 칼륨, 1밀리몰라 DTT, 마이크로리터당 소 세럼 알부민, 마이크로리터 RNA 당 5단위, 마이크로리터 당 15마이크로그램, 마이크로리터 당 15마이크로그램, 15마이크로그램-마이크로리터-마이크로리터 tRNA, 1밀리아알라를 준비한다. 그런 다음 재조합 단백질 PTB 30 마이크로리터와 10 마이크로리터의 RNA를 적절한 풀에서 추가합니다. 섭씨 25도에서 약 30분 동안 체전 반응을 포함하는 튜브를 온도 블록에 놓습니다.
다음으로, 4개의 선택 및 증폭을 통해 결합되지 않은 RNA로부터 결합된 RNA를 분수한다. 먼저, 진공 매니폴드에 부착된 니트로셀룰로오스 필터를 통해 실온에서 100마이크로리터 샘플을 필터링합니다. RNA 단백질 복합체는 필터에 남아 있습니다.
멸균 면도날을 사용하면 필터를 조각으로 자르고 원심분리기 튜브에 삽입합니다. 필터 조각을 단백질Ae K 버퍼에 담그고 RNA를 복구하기 위해 최소 3시간 또는 하룻밤 동안 텀블러에 놓습니다. RNA 시료를 탈단백질화하려면 상온에서 5분 동안 페놀 클로로폼, 소용돌이 및 원심분리기의 동일한 양을 고속으로 첨가합니다.
수성 상을 얻고 클로로폼으로 다시 추출하십시오. 그 후, pH 5.2및 절대 에탄올의 2~ 3권에서 3개의 어금다 나트륨 아세테이트의 1/10 부피와 상체를 혼합한다. 튜브를 영하 80도 의 냉동고에 30 분 동안 방치한 다음 원심 분리기를 10 분 동안 고속으로 둡니다.
70%에탄올로 세척 및 건조 단계를 반복하고 DEPC 처리 된 물에서 RNA를 용해시합니다. 필터 바인딩 분석의 첫 번째 라운드 후, 세 라운드를 더 수행합니다. 다음으로, 단백질바운드 RNA 분획을 언바운드 분수로부터 분리하기 위해 두 차례의 전사, 결합 및 증폭을 수행한다.
5배 TBE 버퍼에서 60대 1 아크릴아미드-비스 아크릴아미드 비율을 가진 네이티브 5% 폴리아크릴아미드 젤을 미리 캐스팅합니다. 그런 다음 RNA 단백질 결합 반응을 설정합니다. 젤을 섭씨 4도의 차가운 방에 5배 TBE 버퍼로 채워진 전기 전광 장치에 놓습니다.
15분 동안 250볼트를 바르고 바인딩 반응을 다른 우물로 피펫합니다. 그런 다음 1~2시간 동안 250볼트에서 전기전도를 실행하여 결합되지 않은 RNA로부터 결합된 RNA를 더 분수합니다. 다음으로, 젤을 엑스레이 필름에 노출시키고, 사인방사선을 사용하여 결합된 RNA의 위치를 식별한다.
결합된 RNA로 젤 슬라이스를 잘라 튜브에 삽입합니다. 젤 슬라이스를 분쇄하고 단백질Ae K 버퍼에서 3시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 이전에 설명한 바와 같이 페놀 클로로폼 및 클로로폼으로 추출을 반복합니다.
용존 된 RNA로부터 cDNA를 합성합니다. 10x RT 버퍼 2개, AMV 역실사 2편, 역프라이머 1편, 물 5마이크로리터, 용존 RNA 10마이크로리터 등 20마이크로리터의 반응에 대비한다. 섭씨 42도에서 60분간 배양하세요.
앞서 설명한 대로 20~25PCR 주기를 사용하여 cDNA를 증폭한다. RNA 합성, 단백질 결합 및 단백질 결합 및 결합되지 않은 분획의 분리 과정을 반복합니다. 단백질 결합을 분석하려면, 젤 이동성 이동 분석 또는 필터 결합 분석기를 사용하여 각 풀 내의 선택된 풀 또는 개별 서열에 대한 결합 친화성 및 특이성을 결정합니다.
사인 방사선 촬영 또는 인광 탐지기를 사용하여 바운드 된 분수 및 바운드되지 않은 분획에서 밴드를 감지하고 정량화하십시오. 복제 및 시퀀스 정렬을 통해 프로토콜을 계속 합니다. 이 연구에서는 성공적인 선택 증폭을 달성했습니다.
300배 더 높은 단백질 농도를 가진 포유류 폴리피리미딘-요로 결합 단백질은 풀 제로 서열에 거의 검출가능한 결합을 나타내지만 선택된 서열 풀에 대한 높은 친화력을 나타낸다. 선택 증폭은 선호하거나 합의 결합 부위를 가진 RNA 결합 단백질에 성공적으로 확인되었습니다. 상류 3-프라임 스플라이스 사이트에 결합하는 재조합 PTB의 첨가는 대안 또는 하류 3-프라임 스플라이스 사이트의 활성화로 이어집니다.
대조적으로, 재조합 hnRNP C의 추가는 둘 다 3개의 프라임 스플라이스 사이트의 억압으로 이끌어 냅니다. 재조합 일반 접합 계수 U2AF65의 첨가는 hnRNP C-매개 3-프라임 스플라이스 사이트 억압을 반전시켰다. 각 바인딩 단계에서 높은 접이식 보강을 제공하는 좋은 무작위 라이브러리와 적절한 바인딩 조건이 성공을 위해 필요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
적절한 기능 적 검사 및 생체 내 테스트를 사용하여 이 방법의 결과를 검증할 수 있습니다. 유전자 발현 분야에서, 수많은 단백질의 기능은 이 기술을 사용하여 공부되었습니다. 폴리아크릴아미드 및 방사능으로 작업하는 동안 장갑과 방사성 씰을 보호하려면 보호해야 합니다.
