우리는 신경 튜브 이미지 Shlomi Krispin 감사합니다. 특히, 우리는 GFP의 transfection 기술을 시작을위한 Yuval 계피를 인정합니다. 이 작품은 CK하는 이스라엘 과학 재단, 협회 테크 프랑세즈 contre 레 Myopathies하고, 도이치의 Forschungsgemeinshaft, 공동 연구 센터 488에서 보조금에 의해 지원되었다

1. Micropipettes의 준비 우리는 13.5의 열 설정을 표준 Narishige PP - 83 피펫 끌어당기는에 우리 pipettes를 가져옵니다. 정확한 설정은 8시 사이에 10 미크론의 피펫 팁의 직경을 목표로, 보정해야합니다. 우리는 필라멘트 함유 1.0 mm와 0.75-0.78 mm의 내경의 외부 직경 borosilicate 유리 튜브를 사용합니다. pipettes은 결과적으로 접시의 가장자리에 접촉으로부터 보호 도움말과 플라스틱 그릇에 저장됩니다. 2. DNA 준비 관심 플라스미드는 DH5α E.으로 transfected 있습니다 표준 절차를 사용하여 대장균. 하나의 식민지에서 숙박 문화는 플라스미드를 사용 맥시 - 준비 키트 (상업적 키트해야) 정화하는 데 사용됩니다. 우리는 1.0의 플라스미드 농도 비 clonal 주사에 대한 μg / μL를 사용합니다. 높은 농도는 피펫 팁의 막히는을 향상시킬 수 있습니다. clonal 어플 리케이션의 경우, 플라스미드 농도는 훨씬 낮은 있으며 (아래 참조) 조정해야합니다. pCAGG - GFP 들어, clonal 결과를 생산 최적의 농도는 약 0.05-0.1 μg / μL로 발견되었습니다. 플라스미드 중 하나 2 μL는 일반적으로 실험마다 사용되며, 실험이 시작되기 전에 빨리 녹색 분말의 최소 금액 (건조하고 날카로운 유리 피펫의 팁을에 준수) 플라스미드에 추가됩니다. 플라스미드는 다음 최대한의 속도로 2 분 탁상 원심 분리기에 centrifuged 있습니다. 이 절차는 피펫 - 막히는 문제를 줄일 것으로 보인다. 3. 태아의 분사 배아 3.1 준비 우리는 주사에 대한 퀘일뿐만 아니라 닭고기 계란을 사용합니다. 달걀은 원하는 발달 단계까지 자신의 긴 축 위에 누워 incubated 수 있습니다. 달걀은 70 % 에탄올로 채취하고 건조 사용할 수 있습니다. 계란의 지적 끝 외과 가위 (이 밖에 닭고기 계란에 필요합니다) 1 ML (퀘일즈) 또는 10 ML 주사기 (19G 바늘)와 난자에서 그림이 그려진 횐자위 2 ML (여자)와 피어싱입니다. 구멍 그런 다음 따뜻한 파라핀과 함께 봉인하고 있습니다. 실제 주입하기 전에, 창이 수술 가위를 이용하여 알 껍질의 상단에 열립니다. 쉘을 통해 끈끈한 테이프를 배치하고 그것을 통해 절단하면 껍질에서 파편을 줄일 수 있습니다. 항생제를 포함하는 PBS 버퍼는 계란으로 즉시 pipetted입니다. 배아에 액세스하려면 vitelline 및 / 또는 amniotic 점막에 상처가 있으며 바늘 홀더에 장착된 0.14 mm 곤충 핀을 사용하여 전환. 무독성 잉크가 (펠리칸 # 17)를 사용, 배아를 시각화에 도움이되는 배반엽 아래 주입하는 흡인기에 탑재된 모세 화재를 뽑아. 3.2 micropipettes의 로딩과 장착 풀러 micropipettes은 흡인기에 탑재, 적절한 직경의 불꽃 뽑아 모세 혈관에 의해 플라스미드로 로드할 수 있습니다. 플라스미드의 최소 금액은 날카롭게 팁하기 위해 개방 반대에서 피펫으로 모세관과로드를 사용하고, 가능한 한 내부에서 팁을 접근 그려진 것입니다. 피펫은 따라서 인젝터가 micromanipulator에 탑재된 수동 공기 압력에로드됩니다. 최소 압력은 플라스미드 솔루션 피펫의 끝에 도달 수 있도록, 필요한 경우 적용됩니다. 3.3 플라스미드 주입 피펫 팁의 막히는 것을 방지하기 위해 공기 압력을 적용하는 동안 피펫은 계란의 액체 매체로 조작할 수 있습니다. 관련 조직 도메인에 피어싱입니다. 팁이 조직을 입력으로 압력의 변화는 종종 눈에 보이는 빠른 그린과 플라스미드 릴리스 충분하다. 이 경우가 아니라면 빠른 / 플라스미드 녹색이 나옵 때까지, 주사기에 약간의 압력을 적용합니다. 이 과정은 인접 somites 예를 또는 신경 튜브의 정도 함께 배아의 축을 따라 반복 수 있습니다. 주사 후, PBS를 추가할 수 있습니다. 창이 (parafilm 특히 퀘일에 대해 바람직하지 않습니다 계란 - 그것은 껍질을 통해 산소의 교환을 차단하여 아마도 배아 사망 속도 증가) 끈적끈적한 테이프를 사용하여 밀폐 있습니다. 치료 배아는 인큐베이터에 반환됩니다. 통풍을 피하십시오 그들이 수분과 증가 수확량을 유지로 인큐베이터에서 물을 작은 용기를 놓습니다. 4. 사출 매개 변수를 조정하고 성공 요금 모니터링 Asessing 다양한 사출 매개 변수를 보정하면 단일 세포 분석을 목표로 응용 프로그램에 중요합니다. 하지 않는 분사 이벤트는 단일 세포의 성공적인 레이블로 이어질 것입니다. 높은 장애 율이 매우 낮은 농도 결과를하면서 너무 높은 농도는 플라스미드가 아닌 clonal 라벨을 초래할 수 있습니다. 주입 플라스미드의 농도가 clonal 주사에 최적화된해야합니다. 우리는 미리 정해진 농도 개별 preps을 diluting보​​다는 전체를 정화 플라스미드 주식 희석하는 것이 좋습니다. 후자의순도의 변화와 같은 supercoiled 플라스미드의 비율과 같은 다른 매개 변수에 의한 아마도 성공 요금의 몇 가지 변화를 소개 수도 있습니다. 전체 마운트 관찰에 의해 평가 4.1 성공 요금 주입된 배아의 초기 평가는 형광등 아래에 전체 쌍안경 마운트 관찰하여 수행할 수 있습니다. 여섯 시간에서 여덟 시간 후 주사 pCAGG 향상된 GFP 구조와 성공 속도를 평가하기에 충분합니다. 이것은 대상 사이트 (예 등의 체절, 등의 신경 튜브, ectoderm 등은 그림 1A - C를 참조하십시오.) 쉽게 나타나지 정도로 표면입니다 제공됩니다. 이 단계는 너무 많은 레이블 셀 또는 다른 방법으로, 어떤 형광 세포를 부족 중 하나를 전시 실험 일련의 평가 특히 도움이됩니다. 추가 부화가 원하는 경우, 항생제 함유 PBS 솔루션은보고 후 계란에 추가되어야하며 씰링 테이프 교체해야합니다. 시리얼 - 섹션 분석하여 4.2 평가 clonality 성공적인 주사의 속도를 평가하기위한 가장 좋은 수단은 주입된 배아를 순차적 - sectioning와 라벨 세포를 시각화하는 immunohistochemistry를 사용하는 것입니다. 이러한 조건에서 배양 시간 4 시간 후 주사처럼 짧은 수 있습니다. 배아는 고정과 파라핀의 sectioning (또는 cryosectioning)에 대한 처리됩니다. 유리 장착 섹션 다음 드 paraffinized과 기자의 시각화를위한 단백질 묻은 있습니다. 이러한 비오틴 - streptavidin과 같은 증폭 방법은 바람직하지 수 있습니다. 마지막으로, 시리얼 섹션은 주입 세그먼트에 표시 세포를 감지하기 위해 스캔됩니다. 오히려 하나의 세포보다 여러가를 얻을 수있다 초기 실험에 따라면, 플라스미드 주식은 희석해야하며 충분한 결과를 얻을 때까지 프로세스를 반복했다. 플라스미드 주식 솔루션의 두 10 배 dilutions가 너무 높습되고 성공적인 요금의 경우에 필요할 수 있습니다. 각각의 플라스미드가 transfected하기 위해서는, clonality를 보장합니다 철저한 교정을 반복해야합니다. 5. 대표 결과 태아 1 2 당 6-12 세그먼트를 타겟으로하는 우리는 일반적으로 체절마다 pCAGG - GFP의 단일 주사를 수행합니다. 이 설정에서 확실한 신호는 열명 중에 한분 배아 중 하나 이상 구간에서 전체 마운트 관찰 8 시간 게시 주입에 의해 감지하실 수 있습니다. 이러한 조건에서 라벨이 추가 (그림 1B, C) clonal으로 확인되었다. 높은 DNA의 농도를 사용할 때, 대부분의 태아는 여러 세포 transfected되었다는 가능성을 높이는, 적어도 하나의 성공적인 주사를 발생할 수 있습니다. 시리얼 섹션 분석 성공률이 10 % 정도되었을 때 clonal transfections가 달성되었다 것으로 나타났다. 이것은 clonality를 달성하기 위해, 기법, 정의 당 매우 비효율적임을 의미합니다. 반면에, 이러한 조건에서 긍정적인 라벨링 이벤트 이상의 93%는 clonal 한 것으로 밝혀졌다. <img src="/files/ftp_upload/2133/2133fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 신경 및 골격 progenitors에 pCAGGS - GFP의 Clonal 주사. 지느러미 신경 튜브 라벨 (NT) (A), dermomyotome (DM) (B)의 ventrolateral 도메인 또는 중앙 DM 시트 (C)를 ​​표시 (AC) 가로 섹션 , 단일 시조로 pCAGGS - GFP의 microinjection 후 6hr. (D) 진피 (D)뿐만 아니라 근육 (M) (심판을 참조하십시오. 자세한 내용은 1) 모두에서 파생을 생성한 중앙 DM, 단일 progenitors의 clonal transfection 다음 두 가지 일.

<ol>
	<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates.">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium,+smooth,+and+striated+muscle.">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li><li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+.">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. .</a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos.">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

위에서 설명한 방법은 작은 세포 하위 집합 또는 단일 progenitors 3 lipophilic 염료를 전달하기위한 이전에 설명한 기법의 수정입니다. 이것은 표준 electroporation 기법을 통해 세 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, electroporation보다 훨씬 큰 공간 해상도 (C, 예를 들어 그림 1B에 대한 참조) 허용, 대상 조직에 대한 신뢰 개별 사이트로 라벨을위한 수단을 제공합니다. 둘째, 따라서 달리 정상적인 조?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pipette tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>B100-75-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>2-000-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insect needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Watkins &amp; Doncaster</td>
<td>E6871</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>03-031-1B</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

single cell transfection in chick embryos

발달 생물학의 중심 주제는 lineages의 다변화 및 ​​기본 분자 메커니즘의 해설입니다. 이것은 정상 및 실험 조건에서 단일 세포의 운명의 철저한 분석을 알아볼 수 있습니다. 이를 위해 하나의 progenitors를 대상으로 transfection 방법은 꼭 필요합니다. 우리는 여기에 유전자 조작뿐만 아니라 신뢰할 수있는 추적 혈통, - 비켜에서 닭 조직에서 단일 세포를 transfecting 수를위한 기술적 간단한 방법을 설명합니다. 특정 조직 도메인은 체절 또는 신경 튜브 내에 타겟으로하고 있으며, DNA가 단일 세포의 산발적 transfection 그 결과, 관심의 상피에 직접 주입합니다. 기자를 사용 clonal 인구는 따라서 3 일이에 추적될 수 있으며, 유전자 조작 clonal 인구의 동작은 컨트롤의와 비교할 수 있습니다. 이 방법은 유전자 조작을위한 새로운 도구와 함께 여자는 배아의 접근을 활용합니다. 우리는 비교하고 널리 사용되는 electroporation 방법을 통해 장점과 가능한 응용 프로그램을 토론하고 또한 제안 추가에서 - 생체내 모델에 사용합니다. 우리는 기존의 혈통 추적 및 유전자 간섭 도구 상당한 또한 및 보완이 방법의 사용을 옹호.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transfection in Chick Embryos at JoVE.com

Single Cell Transfection in Chick Embryos

좋은 팁을 사용하면 우리가 닭 somites이나 신경 튜브의 하위 도메인에 플라스미드 DNA를 주입 micropipettes. 플라스미드의 농도는 단일 transfected 세포를 생성하기 위해 조정됩니다. 우리는 다음 세포가 clonal 인구로 발전 수 있습니다.

칙 태아의 단일 세포 Transfection

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

single-cell-transfection-in-chick-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K 조회수.  Hadassah Medical School - Hebrew University. 좋은 팁을 사용하면 우리가 닭 somites이나 신경 튜브의 하위 도메인에 플라스미드 DNA를 주입 micropipettes. 플라스미드의 농도는 단일 transfected 세포를 생성하기 위해 조정됩니다. 우리는 다음 세포가 clonal 인구로 발전 수 있습니다.

비디오: Single Cell Transfection in Chick Embryos

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

6.5 DPC 마우스 태아의 해부

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

연구

생물학

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

HH 스테이지 10 치킨 태아의 비켜 Electroporations에서

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

마우스 콘 Photoreceptors에서 단일 셀 석션 레코딩

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

의 얼굴 이식<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 태아

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...