원뿔형 플레이트 점도를 통한 인간 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 대 한 균일 한 전단 분석

이 프로토콜을 사용하면 전단이 용액의 세포에서 작동하는 방식에 대한 다양한 질문에 답할 수 있으며 전단 지속 시간과 크기에 대한 상당한 제어를 제공합니다. 고정된 세포에 대한 전단의 효과를 감지하는 다른 기술과 달리 이 기술은 용액의 세포에 전단을 적용할 수 있게 해주며 다운스트림 신호 검출 방법의 스펙트럼에 빌려줍니다. 동의에서 말초 혈액을 얻은 후, 3.8%의 트리나트륨 구연산의 4.5 밀리리터 튜브에서 건강한 성인 기증자, 혈소판이 풍부한 혈장을 얻기 위해 혈액 원심분리기, 45도 각도로 자른 파이펫 팁을 사용하여 결과 상단, 흐린, 노란색 혈소판이 풍부한 플라즈마 층을 조심스럽게 제거한다.

완전한 혈액 수를 통해 혈소판 수를 얻고, 혈소판 수를 약 2.5 배 10으로 조정하여 마이크로리터 당 다섯 번째 혈소판당 제5 혈소판으로 풀이 된 인간 혈소판이 없는 플라즈마를 갖는다. 그런 다음 서스펜션을 섭씨 22도에 부드럽게 회전시 놓습니다. 리간드 처리를 위해 혈소판이 풍부한 혈장에 관심 있는 항체 또는 리간드를 천천히 추가하고 혈소판을 부드럽게 섞습니다.

인큐베이션 중에 원뿔판 비스코마를 켜고 플레이트 온도를 섭씨 22도로 설정합니다. 5-10분 후, 처리된 혈소판이 풍부한 플라즈마를 플레이트 중앙에 직접 온도 조절 된 콘 플레이트 비스코머에 전달하여 모든 샘플이 접촉 지점에서 콘과 플레이트 사이에 증착되는 것을 주의하십시오. 샘플에 전단을 적용하려면 비스혜성 매뉴얼에 따라 전단을 계산하고 적절한 속도와 지속 시간으로 샘플에 전단을 적용합니다.

응용 프로그램의 끝에서, 샘플이 플레이트와 콘 둘 다와 접촉유지되도록 플레이트에서 약 2밀리미터 원뿔을 들어 올리고, 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 샘플 부피의 중심에서 5~10 마이크로리터를 수집한다. 그런 다음 실온에서 20 분 동안 관심있는 표면 마커에 대한 항체로 전단 샘플을 배양하고 실온에서 20 분 동안 2 %의 파라 포름알데히드로 샘플을 수정합니다. 유동 세포측정에 의해 샘플을 분석하려면 각 조건에 대해 적어도 20, 000개의 이벤트를 수집하고 각 형광마커의 신호 강도를 정량화하고 각 형광의 강도에 대한 높이 값을 이용하여 정량화한다.

그런 다음 소 세럼 알부민 또는 차량으로 음의 제어를 사용하여 부정적인 배경 형광 이벤트를 제외하고 게이트를 그리고 모든 실험 조건에 대한 게이트 내부의 이벤트의 백분율을 정량화합니다. 전단 력 응용 프로그램에 대한 응답으로 혈소판 활성화 마커 발현은 시간에 따라 조절되지 않습니다. 여기서, 혈당 단백질 1b-IX의 N단말 도메인을 표적으로 하는 2개의 항체의 존재하에 인간 혈소판 활성화의 대표적인 판독및 정전기 조건 하에서 하나의 대조항체가 도시된다.

3개의 활성화 마커 의 발현은 정전기 조건 또는 제어 항체의 존재에 비해 전단력 및 표적 항체의 존재에서 현저하게 증가하였다. 특히, 혈당 단백질 1b-IX 활성화를 유발하기에너무 낮은 결합력으로 항체를 사용하여 처리하면 정적 또는 전단 힘 조건 하에서 혈소판 활성화 마커 업조절을 유발하지 않습니다. 또한, 당단백질 1b-IX에 대하여 항체를 포함하는 면역 혈전 세포성페니아 환자로부터 혈장은 당단백질 1b-IX 표적화 항체가 없는 환자로부터 혈장과 대조적으로 전단 의존반응을 유발한다.

유량 분석 외에도 전단에 노출된 세포는 단백질 레벨의 변화를 결정하기 위해 서부 얼룩, ELISA 및 질량 스펙 분석을 위해 용액을 제거할 수 있습니다. 언제나처럼, 혈액 이나 인간의 샘플을 사용 하는 경우, 적절 한 보호 장비를 착용 하 고 실험실 안전 및 혈액 태어난 병원 체 지침을 따라야 합니다.