이 연구의 범위는 생리학적 조건에서 혈소판 기능을 평가하는 것입니다. 우리는 특히 미세유체 장치와 생물학적 표면을 사용하여 혈소판 기능을 연구합니다. 그리고 이 접근법을 사용하여 수혈 의학에 적용할 수 있는 혈소판 기능 장애 및 지혈 소생술과 관련된 질문에 답할 수 있었습니다.
현재의 혈소판 기능 분석법은 종종 선택한 특정 작용제에 대한 반응으로 혈소판이 응집되는 능력을 테스트합니다. 검출 방법에는 광 투과 또는 전기 임피던스가 포함될 수 있으며, 이러한 분석은 공정 샘플을 활용할 수 있으며 정체되어 테스트됩니다. 이 미세유체 접근법을 사용하여 혈소판 기능을 테스트함으로써 유체 역학을 통합하여 생리학적 관련성을 더합니다.
유체 역학은 지혈 중 혈소판 기능과 관련된 생물학적 메커니즘에서 중요한 역할을 합니다. 출혈 환자의 경우, 혈소판 기능과 더 나은 결과를 위해 혈소판 기능을 향상시킬 수 있는 치료 개입에 대해 특히 우려하고 있습니다. 이 혈소판 기능 검사 접근법을 사용하여 실험에서 다양한 혈소판 집단의 기여도를 추적하고 외상 및 기타 출혈 상태에 대한 치료 옵션을 평가하는 방법을 찾을 수 있습니다.
시작하려면 실리콘 엘라스토머 베이스를 계량 접시에 붓습니다. 실리콘 경화제를 10:1의 비율로 첨가하고 혼합물을 철저히 저어 실리콘 폴리머 사슬의 적절한 가교를 보장합니다. 마스터 몰드를 페트리 접시에 넣고 경화되지 않은 PDMS를 몰드에 고르게 붓습니다.
그런 다음 페트리 접시를 진공 데시케이터에 30분 동안 넣어 혼합물에서 거품을 제거합니다. PDMS 경화를 완료하려면 금형을 섭씨 70도로 설정된 오븐에 90분 동안 넣습니다. PDMS 경화가 완료되면 면도날이나 메스를 사용하여 미세유체 캐스트를 잘라냅니다.
채널 가장자리에 구멍을 뚫습니다. 이제 유리 슬라이드와 에칭된 면이 위쪽을 향하도록 미세유체 주조물을 플라즈마 세정제에 넣습니다. 진공 펌프를 시작하고 챔버를 밀봉합니다.
그런 다음 플라즈마 클리너를 높음 설정으로 전환하고 설정을 클리너에 30초 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 플라즈마 클리너를 끄고 진공 청소기를 해제하십시오. 플라즈마 세척 캐스트와 유리 슬라이드를 바인딩하려면 플라즈마 클리너에서 위를 향하고 있는 면을 함께 부드럽게 누릅니다.
미세유체 장치를 오븐이나 섭씨 70도의 열판에 10분 동안 올려 놓고 바인딩 과정을 완료합니다. 이제, 지정된 입구로 지정된 배출구를 통해 1형 말 섬유소 콜라겐 시약으로 미세유체 챔버를 코팅합니다. 코팅된 콜라겐이 채널 내에서 증발하는 것을 방지하기 위해 장치를 따뜻하고 습하며 밀폐된 용기에 보관하십시오.
1시간 후 코팅의 반대 방향으로 PBS로 장치를 헹구어 콜라겐 용액을 씻어냅니다. 우선, 선택한 형광단을 사용하여 형광 접합 CD41 항체로 구연산 전혈을 배양합니다. 너팅 로커에 30분 동안 혈액을 염색합니다.
그런 다음 현미경 및 관련 소프트웨어를 켭니다. 현미경 스테이지로 회수 주사기 펌프 수준을 설정하고 실험 요구 사항에 따라 주사기 펌프 설정을 조정합니다. 그런 다음 미세유체 장치를 현미경 스테이지에 놓고 가장자리를 스테이지에 테이프로 붙여 움직임을 방지합니다.
이제 내경의 1/16 인치 튜브를 엘보우 커넥터에 연결 한 다음 10 밀리리터 주사기에 16 인치 내경 커넥터가있는 10 밀리리터 주사기에 연결하십시오. 10ml 주사기에 멸균 PBS를 채우고 주사기 펌프에 연결합니다. 그런 다음 엘보우 커넥터를 미세유체 장치의 배출구에 삽입합니다.
한쪽 끝에 엘보우 커넥터가 있고 다른 쪽 끝에 각진 절단부가 있는 약 10cm 길이의 입구 라인을 준비합니다. 이제 입구 엘보우 커넥터를 장치 입구에 연결하고 입구 라인을 각진 홀더에 놓인 폐기물 미세 원심분리기 튜브에 배치합니다. 10배 대물 렌즈를 사용하여 미세유체 장치 채널 가장자리에 초점을 맞춥니다.
다음으로 PBS로 라인을 프라임합니다. 주사기 펌프를 수동으로 전진시켜 채널에서 PDMS 또는 파편을 제거합니다. 채널 입구와 출구 근처에 장애물이 있는지 확인하십시오.
이제 저장된 이미지 캡처 설정을 열거나 혈액 샘플의 CD41 항체에 해당하는 명시야 채널 및 형광 채널을 사용하여 1-2초마다 캡처된 시계열 이미지에 대한 새 이미지 캡처 절차를 만듭니다. 여과된 구연산 혈액 샘플을 얻고 실험을 시작하기 직전에 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 샘플을 각진 마이크로 원심분리기 홀더에 놓습니다.
그런 다음 주입 라인을 혈액 샘플에 배치하고 이미지 캡처를 기록하기 시작합니다. 주사기를 천천히 빼내어 튜브의 데드 볼륨을 채웁니다. 혈액이 채널에 도달하면 즉시 주사기 펌프의 재생을 눌러 원하는 순전한 속도로 흐름을 재개하십시오.
혈소판이 미세유체 장치의 협착 영역을 완전히 폐색할 때까지 또는 실험 종료점(일반적으로 10분)까지 실험을 실행합니다. 실험이 완료되면 이미지 캡처를 중지하고 주사기 펌프를 중지합니다. 마지막으로 이미지 캡처를 적절한 저장소에 저장합니다.
