새끼 크기와 배아 생존력을 결정하기 위한 이 프로토콜은 많은 예쁜꼬마선충 실험실에서 사용됩니다. 짐승 크기와 배아 생존력의 감소는 근화, 수정 및 배아 발생과 같은 중요한 발달 과정의 결함을 나타낼 수 있습니다. 이 기술은 초보 예쁜꼬마선충 연구자들에게 명확한 지침을 제공합니다.
설정 및 실행이 비교적 간단하며 새로운 돌연변이 균주로 작업할 때 좋은 출발점입니다. 이 기술의 가장 큰 과제는 배아 대 수정되지 않은 배아 식별입니다. 새로운 연구자들은 이러한 실험을 시작하기 전에 배아, 난모세포 및 다양한 애벌레 단계의 식별을 연습해야 합니다.
시작하려면 플레이트 뒷면에 라벨을 붙이고 개별 L4 단계 자웅동체를 플레이트로 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오. 벌레가 성충으로 발달하도록 하고 섭씨 20도의 표준 배양 온도에서 24시간 동안 자가 자손을 낳습니다.
3일차에 플레이트에 점수를 매깁니다. 다음 날, 새 플레이트 세트에 라벨을 붙이고 하루 종일 개별 웜을 새 플레이트에 옮깁니다. 벌레가 섭씨 20도에서 24시간 동안 배아를 낳도록 합니다.
넷째 날에 플레이트에 점수를 매기십시오. 3일차에 새 플레이트 세트에 라벨을 붙이고 2일차에 개별 웜을 새 플레이트에 옮깁니다. 벌레가 20도에서 24 시간 동안 자손을 낳도록하십시오.
5일차에 플레이트에 점수를 매깁니다. 미세 마커를 사용하여 35mm 뚜껑에 격자 패턴을 그립니다. 이전에 계수된 웜을 추적하기 위해 계수를 위해 테스트 플레이트 아래에 격자 뚜껑을 놓습니다.
차등 세포 계수기를 사용하여 개별 사각형 내에서 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 계산합니다. 사각형 테두리에 있는 웜의 경우 웜 헤드의 위치에 따라 계산됩니다. 머리가 사각형의 상단과 왼쪽 가장자리에 닿는 웜을 세십시오.
살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오. 넷째 날에는 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세어 둘째 날 접시에 점수를 매기고 실험실 노트에 기록합니다. 5일째에는 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세어 3일째 접시에 점수를 매기고 실험실 노트에 기록합니다.
플레이트 뒷면에 라벨을 붙인 후 개별 L4 자웅동체 웜을 플레이트에 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오. L4 수컷 벌레 한 마리를 L 4 자웅동체가 들어 있는 접시에 옮깁니다.
벌레가 짝짓기를 하고 섭씨 20도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 3일차에 살아있는 유충 대 부화하지 않은 배아에 대한 플레이트에 점수를 매깁니다. 다음날, 새 접시 세트에 라벨을 붙이고 자웅동체와 수컷을 새 접시에 옮깁니다.
자웅동체가 성인기에 도달했는지 확인하십시오. 자웅동체가 섭씨 20도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 4일째에 살아있는 유충 대 부화하지 않은 배아에 대한 플레이트에 점수를 매깁니다.
셋째 날에는 새 접시 세트에 라벨을 붙이고 자웅동체와 수컷을 새 접시에 옮깁니다. 벌레가 20도에서 24 시간 동안 자손을 낳도록하십시오. 5일째에 살아있는 배아와 부화하지 않은 배아에 대해 플레이트에 점수를 매깁니다.
감별 세포 계수기를 사용하여 첫날 플레이트에서 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세고 실험실 노트에 기록합니다. 넷째 날에는 둘째 날의 살아있는 자손과 부화하지 않은 배아를 세어 실험실 노트에 기록합니다. 남성용 1 일 접시를 확인하십시오.
짝짓기가 발생하면 수컷에 대한 자웅동체의 예상 유전 비율은 50 대 50입니다. 한 접시에 수컷이 들어 있지 않으면 수컷과 자웅동체 사이의 짝짓기가 일어나지 않았습니다. 이 짝짓기 쌍을 버리고 실험실 노트에 관찰을 기록합니다.
5일째에는 3일째 접시에서 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세어 실험실 노트에 기록합니다. N2에 대한 배아 생존율 분석은 98.9%의 생존율을 보인 반면, him-5(e1490)와 spo-11(ok79)은 각각 74.9%와 0.8%의 비율로 배아 생존율의 감소를 보였다. N2, him-5(e1490) 및 spo-11(ok79)의 평균 새끼 크기는 각각 217, 105 및 219로 결정되었습니다.
예쁜꼬마선충 개발의 다양한 단계에 대한 인식은 정확하고 재현 가능한 데이터를 위해 중요합니다. 사진과 해부 현미경을 사용하여 웜 개발에 익숙해지는 것이 좋습니다. 이 절차는 유전자가 발달 과정에 관여하는지 여부를 결정하는 훌륭한 첫 번째 단계이며 어떤 과정이 중단되었는지 확인하기 위해 세포학적 분석이 뒤따를 수 있습니다.
