멀티플렉스 형광 면역 조직 화학은 다중 세포 유형과 그 위치를 그대로 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직에서 식별하여 세포 식별뿐만 아니라 세포 공간 분석에세포도 허용합니다. 이 수동 기술의 주요 장점은 교차 반응성없이 동일한 종의 다중 항체를 사용하는 것입니다. 이 기술은 종양 마이크로 환경에서 면역 과 암 세포의 상호 작용에 깊이보기를 허용합니다.
이 기술을 처음으로 시도할 때 약 3~4일 동안 염색을 하고 공정 중에 각 단계를 완전히 추적합니다. 염색 공정과 멀티플렉스 설계의 약한 방법은 일반 및 예상 함정을 줄이는 데 중요합니다. 먼저 슬라이드를 분리하고 재수화합니다.
조직 측이 있는 혼성화 오븐에 놓고 한 시간 동안 섭씨 60도에서 굽습니다. 오븐에서 슬라이드를 꺼내 수직 슬라이드 랙에서 5~10분 동안 식힙니다. 그런 다음 슬라이드 염색 세트를 사용하여 자일렌으로 슬라이드를 세 번, 100% 에탄올, 95%에탄올, 70%에탄올을 각각 10분 동안 처리합니다.
슬라이드 랙을 탈온화된 물로 씻은 다음 중립 버퍼링 된 포르말린에 30 분 동안 잠급하여 슬라이드를 수정합니다. 슬라이드를 물로 2분간 세척하고 항원 회수를 진행합니다. 슬라이드 랙을 pH 6.0 또는 pH 9.0 항원 검색 버퍼로 채워진 내열 상자에 넣습니다.
플라스틱 랩으로 상자를 덮고 고무 밴드로 고정하십시오. 상자를 회전판 가장자리에 인버터가 장착한 전자레인지에 넣고 슬라이드를 100%의 전력으로 45초 동안 가열한 다음 20%의 출력으로 15분 간 가열합니다. 마이크로 웨이브 후 15~20분 동안 슬라이드를 식힙니다.
한편, 항체와 형광의 작업 솔루션을 준비합니다. TBST 또는 1X PBS의 50 밀리리터에서 소 세럼 알부민 과립의 0.5 그램을 용해하여 1 차 적인 항체 희석제를 준비합니다. 이전에 결정된 최적화된 농도로 각 1차 항체 작동 용액을 희석시합니다.
1-100의 농도로 불소소 희석제의 각 불소호를 희석시 희석시. 염색의 마지막 날에는 TBST의 1 밀리리터에 3방울의 DAPI를 추가하여 DAPI 작업 솔루션을 준비합니다. 슬라이드가 냉각되면 전자 레인지에서 제거하고 플라스틱 랩을 벗습니다.
2분 간 탈이온물로 씻은 다음 TBST로 2분간 세척합니다. 세척 후, 섬세한 작업 으로 조직 주위슬라이드를 말리고 소수성 장벽 펜으로 조직 외부를 추적하여 조직을 만지지 않도록 주의하거나 건조시키십시오. 각 슬라이드를 가습기 챔버에 넣고 조직에 약 4방울의 차단 용액을 추가합니다.
그런 다음 실온에서 10 분 동안 슬라이드를 배양하고 1 차 적인 항체 응용 프로그램을 진행합니다. 종이 타월 스택에 슬라이드의 측면을 눌러 각 슬라이드에서 차단 솔루션을 제거하고 나머지 솔루션을 제거하기 위해 섬세한 작업 닦아를 사용합니다. 슬라이드를 가습 챔버에 다시 놓고, 작업 1 차 항체의 약 200 마이크로 리터를 추가하고, 한 시간 동안 배양한다.
인큐베이션 후, 세척당 2분 동안 TBST에 잠급으로써 슬라이드를 세 번 씻습니다. 각 슬라이드에서 나머지 TBST를 분리하고 이차 항체의 약 3 ~ 4 방울을 적용합니다. 가습 챔버에서 슬라이드를 10분 동안 배양합니다.
TBST로 슬라이드를 다시 세척하고 약 100 마이크로리터의 플루오로포레 작동 용액을 적용합니다. 슬라이드를 가습 챔버로 되돌리고 10분 동안 배양합니다. TBST 세척을 반복한 다음 원고 지시에 따라 슬라이드를 전자 레인지에 전자 레인지하여 항체를 제거합니다.
이 다일 염색 과정에서 기억해야 할 중요한 것은 마이크로 웨이브 단계 후 멈추고 밤새 항원 검색 버퍼에 슬라이드를 남기고 조직과 얼룩 무결성을 보장하는 것입니다. 항원 회수 용액으로 마지막 항체 응용 프로그램을 제거하고 산화 된 물로 슬라이드를 씻은 다음 TBST가 세척 당 2 분 동안 세척합니다. 항체 플루로포어 쌍의 나머지 부분에 대한 염색 단계를 반복한 다음 DAPI 응용 프로그램을 진행한다.
각 슬라이드에 약 150마이크로리터의 작업 DAPI 솔루션을 적용하고 가습 챔버에서 10분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 TBST로 슬라이드를 약 30초 동안 세척하고 커버 슬립을 장착합니다. 마운팅 미디어가 건조되면 덮개 슬립의 네 모서리에 선명한 손톱 광택을 바르면 고정하십시오.
모노플렉스를 분석하려면 DAPI를 사용하여 250밀리초 노출로 현미경의 슬라이드를 이미지하여 초점을 맞춥니다. 스테인드 마커의 형광 강도를 보고 각 모노플렉스 슬라이드를 평가하고 이 강도를 배경과 비교합니다. 스테인드 마커 강도가 배경보다 5배 이상 높은 경우 최종 멀티플렉스에서 슬라이드 위치를 사용합니다.
멀티플렉스를 염색할 때 각 항체에 대한 적절한 순서를 선택하고 각 플루오로포를 항체에 할당합니다. 앞서 설명한 대로 멀티플렉스를 염색하고 1차 항체, 불소호또는 DAPI 대신 항체 희석제, 불소후 희석제 및 TBST를 받는 빈 슬라이드를 준비한다. 현미경에서 멀티플렉스를 이미지화할 준비가 되면 모든 채널에 대해 노출을 250밀리초로 설정하고 DAPI를 사용하여 각 이미지를 캡처하여 집중합니다.
그런 다음 분석 소프트웨어를 사용하여 형광 거짓 색상및 병리학 보기로 각 멀티플렉스를 평가하여 각 마커의 특이성을 확인합니다. 멀티플렉스 분석의 성공을 보장하기 위해, 모노플렉스 분석은 각 항체의 순서를 결정하기 위해 수행되어야 한다. 예를 들어 Foxp3이 배열의 세 번째 위치에 있을 때 CD3를 통해 특이적이고 견고한 염색 및 공동 지역화가 입증됩니다.
대조적으로 Foxp3이 첫 번째 위치에 있을 때 Foxp3의 비특이적 염색이 발생합니다. 빨간색의 거칠고 효능 영역은 대부분의 슬라이드에 존재하며, 이 지역의 형광 강도는 낮습니다. 이 분석의 또 다른 중요한 단계는 세포 식별 및 추가 분석의 기초인 DEPI 카운터스테인링입니다.
작업 중인 이미지와 작동하지 않는 DAPI를 가진 이미지 간에 명확한 대비를 알 수 있습니다. 멀티플렉스 분석의 경우 아름다운 합성 이미지가 항상 정확한 얼룩을 반영하지는 않습니다. CD3가 시각화되고 특정 염색을 표시하는 동안, CD163의 병리학 밝은 필드 보기는 항체가 비특이적임을 증명한다.
최적의 멀티플렉스 이미지는 복합 이미지에서 특정 염색을 나타내며, CD3 및 CD163 특이성은 병리학 밝은 필드 뷰로 확인된다. 이 절차에 따라 자가 현상 및 공간 분석 계산을 수행하여 세포와 세포 상호 작용을 더 분석할 수 있습니다. 이 기술은 연구원이 종양 면역 미세 환경에 대한 우리의 이해를 발전시키는 세포및 손상되지 않은 조직의 공간 패터닝을 탐구하는 길을 열었습니다.
