이 방법은 성 결정 시스템과 같은 Hymenoptera의 분자 생물학 및 유전 적 영역에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 매핑 및 분자 상태에 필수적인 개미 Vollenhovia Emery를 통해 교배 선을 쉽게 유도할 수 있다는 것입니다. 그래서,이 임무는 특정 개미의 성 결정 시스템에 대한 통찰력을 제공 할 수 있으며 말벌과 같은 다른 개미 및 기타 Hymenoptera 종에도 적용 될 수 있습니다.
프로토콜을 시작하려면 초여름 동안 V.Emeryi 식민지를 수집하십시오. 수집된 나뭇가지에서 유리 덮개가 있는 인공 석고 둥지로 개미 표본을 배관기를 사용하여 옮김합니다. 인공 둥지의 식민지를 25도 C에서 유지하여 16~8시간 의 어두운 주기 하에서 유지합니다.
수돗물을 세척병으로 제공하여 매일 석고를 촉촉하게 유지합니다. 다음으로, 새로운 생식 개미가 나타날 때까지 매일 20 마이크로 리터 팁을 사용하여 알루미늄 호일에 싸인 건조 크리켓 파우더 100 마이크로 그램과 갈색 설탕 물로 채워진 팁을 식민지에 추가하십시오. 필드에서 마이크로 식민지를 수집하고 새로운 여왕과 남성을 얻기위해 그들에게 충분한 음식을 제공하는 것이 중요합니다.
첫째, 15분 동안 섭씨 4도에 설정된 통제된 환경이 있는 방에 식민지를 배치하여 개인이 움직이지 못하게 하십시오. 30 명의 작업자 개미의 중간 다리를 스테레오스코프 아래에 사용하여 F-0 세대를 후속 근친 교배 십자가에서 생산 된 작업자와 구별하십시오. 그런 다음 개미를 새로운 작은 석고 둥지로 옮겨 교배 십자가를 위한 것입니다.
다음으로, 노동자를 포함하는 석고 둥지에 3 ~ 4 개의 애벌레 또는 pube를 추가합니다. 긴 날개 달린 여왕과 남성을 이전에 준비된 석고 둥지로 옮겨 교배 십자가를 갈아입습니다. 이 단계를 위해, 정상적인 식민지와 같은 상태에서 실험 횡단 식민지를 유지하는 것이 중요합니다.
남성과 여성을 함께 배치하는 것만으로는 근친 교배를 유도하기가 어렵습니다. 식민지를 16~8시간 의 빛 아래 25도의 기온으로 유지하며, 여왕이 날개를 잃고 알을 낳을 때까지 음식과 물이 제공되는 어두운 주기입니다. 스테레오 현미경으로 매일 실험 식민지를 확인하십시오.
F-one 자손 사이의 근친 교배 십자가를 설정 한 후, 계란은 입체 스코프에서 관찰 할 수 있습니다. F-one 여왕이 알을 낳기 시작한 후, F-1 세대와 F-2 세대가 혼합되는 것을 방지하기 위해 둥지에서 F-1 수컷과 애벌레 또는 푸브를 제거하십시오. F-2 자손이 나올 때까지 같은 조건하에서 식민지를 유지하십시오.
집게를 사용하여 F-제로 퀸의 한 쪽 다리를 제거합니다. 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 100 마이크로리터의 냉각제를 포함하는 마이크로 튜브로 다리를 옮춥니다. 입체경 아래 집게를 사용하여 300 마이크로리터의 초순수수로 채워진 유리 접시에 암컷 복부를 해부합니다.
짝짓기 남성에서 정자를 포함하는 spermatica를 시뮬레이션. 스퍼마티아의 조직을 벗겨 내고 곤충 핀을 사용하여 여성의 조직에서 정자를 분리합니다. 마이크로 파이 패드를 사용하여, 냉각 제의 100 마이크로 리터를 포함하는 1.5 밀리리터 마이크로 튜브로 정자를 전송.
F-제로 여왕과 정자의 샘플을 섭씨 95도에서 20분 동안 배양합니다. 플래시 센트로는 마이크로 튜브를 융합하고 샘플을 섭씨 4도에 저장합니다. siv-mated F-one 여왕에 의해 계란 생산을 확인 한 후, 창고 날개 또는 하나의 중간 다리와 유전자형을 사용하여 여왕의 DNA를 추출합니다.
다음으로, 한쪽 다리를 지피하여 F-1 남성의 DNA를 추출합니다. 근친 교배 십자가에서 수컷 개미의 비옥을 평가하기 위하여는, 집게를 사용하여 PBS 용액의 400 마이크로리터와 유리 접시에 내부 생식 기관을 해부합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 마이크로 파이 패드를 사용하여 4 % 파라 포름 디히드로 대체하십시오.
실온에서 40 분 동안 PFA의 샘플을 배양하여 조직을 수정하십시오. 고정 후 마이크로 파이 패드를 사용하여 PBS의 400 마이크로 리터로 조직을 다섯 번 씻으시다. PBS에서 밀리리터당 1밀리그램으로 DAPI 용액을 희석합니다.
PBS를 제거하고 희석된 DAPI 염색 용액의 약 300 마이크로리터를 조직에 추가합니다. 어두운 조건하에서 15 분 동안 조직을 배양하십시오. 인큐베이션에 이어, PBS의 400 마이크로리터로 조직을 5번 세척하고 집게를 사용하여 유리 슬라이드의 중심으로 조직을 옮겨.
그런 다음 TRITC 테트라메틸lrhodamine을 포함하는 마운팅 매체에 조직을 장착. 마지막으로 20 또는 60 3x 객관적인 렌즈를 사용하여 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 샘플을 관찰합니다. Haploid 남성 v Emeryi의 고환의 현미경 이미지는 건강한 섬유 조직을 보여주지 않은 디플로이드 남성 v 에메리에 없는 건강한 섬유 조직 또는 정자를 보여줍니다.
디플로이드 남성 v 에메리의 남성 생식 기관은 정자를 생산하지 않았고 그들의 고환은 개발되지 않았으며, 근친 교배 십자가에서 생산된 수컷은 멸균된다는 것을 시사합니다. 개발 후,이 기술은 빠른 타이밍 개미 종에 대한 볼렌호비아 에메리에서 상수에서 섹스 myatony을 탐구하는 방법을 포장.
