이 프로토콜은 환자 샘플에 병원성 항체가 포함되어 있는지 여부를 확인할 수 있었기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 방법으로 쉽게 구별 할 수없는 표면 항원과 세포 내 항원 사이의 반응성을 구별하는 능력에 있습니다. 문화적 해마 뉴런은 새로운 항체를 식별하는 데 사용됩니다.
이러한 새로운 항체의 확인은 결국 단일 요법에서 특이적인 개시를 허용하여 환자 결과를 개선합니다. 이 기술은 신경 표면 단백질로 향하는 병원성 항체와 관련된 질병의 전체 분야로 확장 될 수 있기 때문에 중요합니다. 미세한 곡선의 집게로 배아 머리를 잡고 45도 각도로 한 쌍의 미세한 직선 집게로 궤도를 뚫습니다.
그런 다음 미세한 곡선 집게를 풉니 다. 수술 가위의 도움으로 후두골에서 정면 뼈까지 피부와 두개골을 해부하십시오. 그런 다음 한 쌍의 미세한 곡선 집게로 뇌를 제거하고 최대 절전 모드 플러스 B27로 6 센티미터 접시에 모으십시오.
모든 배아의 뇌가 회복되면 가늘고 곧은 집게를 사용하여 종뇌를 시상으로 분리하십시오. 다음으로, 동면 플러스 B27을 원 안에 1cm 거리에 떨어 뜨려 10cm 접시를 준비하고 한 방울 당 하나의 종뇌를 놓아 해부 스코프를 통해 1.25 X 배율로 시각화합니다. 현미경으로 작업하는 동안 시상을 조심스럽게 제거하고 수막을 벗겨 해마를 더 잘 시각화하십시오.
그런 다음 정밀 스프링 가위로 해마를 해부하십시오. 그리고 최대 절전 모드 플러스 B3.5와 함께 27cm 접시에 넣고 2를 이스트레이트합니다. 모든 해마를 수집하기 위해 절차를 반복하십시오.
해마의 효소 적 해리를 위해, 해마가 들어있는 50 밀리리터 튜브에 2.5 % 트립신 1 밀리리터를 첨가하십시오. HBSS로 튜브의 부피를 5 밀리리터로 가져온 후 섭씨 37 도의 수조에서 튜브를 15 분 동안 배양합니다. 트립신을 더 희석하려면 예열 된 HBSS 10 밀리리터를 넣고 튜브를 섭씨 37도로 설정된 수조에 5 분 동안 다시 넣으십시오.
다음으로 1000 마이크로 리터 마이크로 피펫을 사용하여 점액 덩어리로 나타나는 해마를 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그리고 입증된 바와 같이 6밀리리터의 예열된 HBSS로 조직을 5분 동안 배양합니다. 조직을 기계적으로 해리하려면 해마 덩어리를 원추형 바닥이있는 2 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
예열된 DMEM 배지 1밀리리터를 추가한 후 위아래로 부드럽게 흡인하여 1000마이크로리터 마이크로 피펫으로 펠릿을 균질화합니다. 거품이 생기지 않도록 혼합물이 반투명해질 때까지 팁이 튜브의 원추형 바닥과 접촉하도록 미리 당겨진 유리 피펫으로 위아래 흡인을 10-20 회 반복하십시오. 교차 흔들림 움직임으로 3.5cm 접시에 균등하게 분배하기 전에 세포를 세십시오.
완료되면 접시를 5%이산화탄소와 함께 인큐베이터에 넣습니다. 시험관 내 세포에서 14일의 형광 면역 염색을 위해 Anti-NMDAR 항체가 포함된 샘플을 커버 슬립에 추가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 1 시간 후, 샘플을 4 % 포름 알데히드 및 PBS로 실온에서 5 분 동안 고정 용액으로 처리하십시오.
이어서 샘플을 각각 5분 동안 PBS로 세척하고, 이어서 2차 항체 염소 항-인간 Alexa Fluor 488을 실온에서 1시간 동안 1 내지 1000 희석액으로 첨가하였다. 다음으로, 샘플이 포함된 커버 슬립을 액체 장착 매체로 장착하고 남아 있는 액체를 흡입합니다. 형광 이미징으로 뉴런을 시각화합니다.
칼슘 영상의 경우, 커버 슬립에서 성장한 14-18 일 체외 세포를 사용하십시오. 영상화하기 전에, 세포를 pAAV2 CAG GCaMP 5G를 코딩하는 바이러스 벡터로 세포를 밀리리터당 10 내지 10번째 게놈 카피의 2.5배로 5 내지 7일 동안 처리한다. 이미징하기 하루 전에, 세포를 환자 샘플과 함께 24시간 동안 인큐베이션한다.
이미징 당일에는 설정을 준비하고 현미경 셀 챔버를 섭씨 37도로 설정합니다. 차선을 증류수로 채우고 5 % 이산화탄소를 주입하여 세포의 생리적 조건을 유지하십시오. 세포를 세포 외 생리 학적 용액으로 덮은 후 현미경 세포 챔버로 옮깁니다.
10 마이크로 몰 NBQX를 추가하여 AMPA 및 KA 수용체를 차단하고 NMDA 수용체 반응을 시각화합니다. 100밀리초마다 기록된 프레임으로 4분 분량의 동영상을 가져옵니다. 인수를 시작한 직후, 접시에 자극 용액을 추가하십시오.
자극시, 대조군과 환자의 뇌척수액 또는 CSF 샘플과 함께 배양한 배양물로부터 시간에 따른 형광 신호를 추출하여 Image J.It 와 같은 처리 소프트웨어를 사용하여 시험관내 하루 동안 세포가 고르게 분포되고 플레이트에 부착되어 세포체 주위에 라멜라가 발달하고 작은 신경돌기가 확장되기 시작하는 것을 관찰하였다. 배양에서 며칠 후, 신경 돌기는 짧은 거리를 확장했고 세포는 상당한 분극을 보였다. 신경 네트워크는 계속 성장하고 복잡해졌습니다.
18 일에 뉴런은 성숙하고 상호 연결되어 뉴런 네트워크를 구축했습니다. 대표적인 형광 이미지는 선택적 마커를 사용하여 18일에 성숙한 뉴런을 보여줍니다. 환자 샘플과 함께 배양물을 배양하면 뉴런 표면에 존재하는 NMDA 수용체를 인식하는 자가 항체가 포함되어 있기 때문에 강렬한 형광 신호가 생성되었습니다.
대조적으로, 대조군 샘플은 뉴런 배양물에 투여될 때 형광 신호를 생성하지 않았다. NMDA의 적용은 세포내 녹색 형광의 변화에 의해 나타난 바와 같이 형광 강도를 증가시켰다. 자극기가 적용되었을 때, 대조군 CSF 샘플로 처리된 뉴런은 환자 CSF 샘플로 처리된 세포보다 형광 강도에서 더 높은 차이를 보였다.
해마의 재산 식별 및 해부는 문화의 순도를 결정합니다. 세포 응집은 특히 배양물을 영상화 목적으로 사용할 때 핵심 인자이다. 또한 배양된 해마 뉴런을 사용하여 면역침전 및 질량 분석 기술과 결합할 때 새로운 항체 및 표적 항원을 식별할 수 있습니다.
이 기술은 항체 매개 질환의 새로운 범주의 특성화를 허용했습니다. 따라서 나노 면역학의 새로운 분야를 연구하는 데 필수적입니다.
