이 방법을 사용하면 기존의 차등 초원심분리로 달성한 것보다 더 높은 순도를 가진 간암 조직 유래 작은 세포외 소포를 분리할 수 있습니다. 이 기술은 간단하고 편리하며 작동하기 쉬워 작은 세포외 소포체 연구를 위한 방법론적 지원을 제공할 수 있습니다. 시작하려면 섭씨 80도 냉동고에서 조직 샘플을 꺼냅니다.
약 400 밀리그램의 조직을 아이스 박스의 10 센티미터 세포 배양 접시에 넣고 메스로 조직을 잘게 다진다. 조직을 1.5 밀리리터의 소화 용액으로 6 웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 플레이트를 전이 탈색 셰이커에 놓고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하여 간암 조직의 완전한 해리와 작은 세포외 소포 또는 sEV의 방출을 위해 배양합니다.
배양 후 6 웰 플레이트를 아이스 박스에 놓습니다. 80 마이크로 리터의 포스파타제 억제제와 200 마이크로 리터의 완전한 프로테아제 억제제 용액을 첨가하여 소화를 중지시킵니다. 그런 다음 소화액을 2 밀리리터 원심 분리기 튜브에 놓인 70 마이크로 미터 세포 여과기로 옮기고 천천히 여과하여 큰 조직 파편을 제거합니다.
여과액을 500g에서 10분 동안 원심분리하여 작은 조직 파편을 제거하고 새로운 2밀리리터 원심분리기 튜브에 상층액을 수집합니다. 상층액을 3, 000 g에서 20분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거한다. 피펫 끝이 바닥의 흰색 파편에 닿을 때까지 상층액을 새 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
남은 액체의 원심분리를 반복한 후 파편을 방해하지 않고 상층액을 튜브에 모읍니다. 수집 된 상청액을 12, 000 g에서 20 분 동안 원심 분리하고, 상청액 900 마이크로 리터를 4.7 밀리미터 초 원심 분리 튜브로 옮긴다. 나머지 액체의 원심분리를 반복한 다음 두 상층액을 수집하여 동일한 초원심분리기 튜브에 혼합합니다.
튜브를 PBS로 완전히 채웁니다. 상층액을 100, 000 g에서 60 분 동안 원심 분리한다. 상층액을 버린 후 초원심분리기 튜브에 PBS를 채워 펠릿을 재현탁합니다.
100, 000 g에서 60 분 동안 원심 분리를 반복 한 후, 50 마이크로 리터의 PBS로 펠렛을 재현탁한다. 1밀리리터 멸균 주사기를 사용하여 sEV 현탁액을 흡인하고 0.22마이크로미터 멤브레인 필터를 통해 600마이크로리터 원심분리기 튜브로 여과합니다. 추가 분석을 위해 여과액을 섭씨 80도에 보관하십시오.
나노입자 유세포분석기를 사용하여 sEV의 크기 분포와 순도를 결정합니다. 세척액의 양을 확인하십시오. 그런 다음 외피와 폐액의 수위 차이를 확인하십시오.
계측기의 주 전원 공급 장치를 켠 후 20초 후에 컴퓨터를 켭니다. 소프트웨어를 실행하기 위해 기기가 제대로 연결되었음을 나타내는 신호음이 울릴 때까지 기다리십시오. 시작을 클릭하여 카메라, 레이저 및 공기 펌프를 켭니다.
그런 다음 Sheath Flow를 클릭하고 Start Up을 선택합니다.로딩 플랫폼에 초순수를 놓습니다. 4분 후 Sample and Boosting(샘플 및 부스팅)을 클릭한 다음 Unload in Sample(샘플에서 언로드)을 선택합니다. 30초 후 블랭크 튜브를 로딩 플랫폼에 놓습니다.
Sample(샘플)을 클릭하고 Boosting(부스팅)을 선택한 다음 Unload in Sample(샘플에서 언로드)을 선택합니다. 그런 다음 초순수가 들어 있는 튜브를 로딩 플랫폼에 놓습니다. 동시에 Sample and Boosting(샘플 및 부스팅)을 클릭한 다음 Sheath Flow 및 Purge를 클릭합니다.
Manual Operation(수동 작동)을 클릭하고 입자 농축 튜브를 로딩 플랫폼에 놓습니다. 그런 다음 샘플을 클릭하고 1분 동안 부스팅을 선택한 다음 샘플 정보에서 250 나노미터 표준 형광 실리카 나노 스피어 품질 관리를 동시에 선택합니다. S를 선택합니다.ampS에서 샘플링, SPCM을 클릭하여 감지기를 켭니다.
그런 다음 자동 샘플링을 클릭하고 샘플링 세트에 1.0을 입력하여 압력을 1킬로파스칼로 고정합니다. 도구 모음에서 를 클릭하고 Large Signal을 선택합니다. 레이저의 수평 위치를 조정하고 레이저를 2마이크로미터로 설정합니다.
그런 다음 L과 R을 계속 클릭하여 신호가 강하고 균일한지 확인합니다. Time to Record(기록 시간)를 클릭하여 데이터를 수집하면 완료되면 자동으로 Buffer(버퍼)로 이동합니다. 그런 다음 데이터를 Nfa 파일에 저장하고 샘플을 클릭하여 언로드를 선택합니다.
세척 용액 튜브를 로딩 플랫폼에 놓습니다. Sample(샘플)을 클릭하고 Boosting(부스팅)을 선택한 다음 1분 후에 Sample and Unload(샘플 및 언로드)를 클릭합니다. 초순수를 사용하여 모세관 팁에 남아 있는 세척액을 제거합니다.
로딩 플랫폼에 입자 크기 표준 튜브를 놓고 1분 동안 Sample Boosting을 클릭합니다. 샘플 정보에서 68 to 155 S16M-Exo 품질 관리를 선택하고 샘플을 클릭한 다음 샘플링을 클릭합니다. 그런 다음 도구 모음을 클릭하고 Small Signal을 선택합니다.
Time to Record(기록 시간)를 클릭하여 데이터를 수집하면 완료되면 자동으로 Buffer(버퍼)로 이동합니다. 그런 다음 데이터를 Nfa 파일에 저장하고 샘플을 클릭하여 언로드를 선택합니다. 세척액으로 잔류물을 제거한 후 PBS 튜브를 로딩 플랫폼에 놓고 입자 크기 표준 튜브에 대해 시연된 단계를 수행합니다.
다음으로, 앞서 설명한 대로 모세관 팁을 세척하고, sEV 샘플을 로딩하여 입자 크기 표준 튜브에 대해 앞서 설명한 데이터를 분석한다. 정제된 sEV를 투과전자현미경으로 조사한 결과, 컵 모양의 형태를 가진 sEV의 존재가 밝혀졌다. sEVs에 대한 유세포 분석을 수행하였다.
그리고 입자 크기는 40 내지 200 나노미터이고, 평균 입자 크기는 89 나노미터였다. 농축된 sEV의 순도는 68.32%로 나타났으며, CD63, CD9, TSG101과 같은 sEV의 단백질 마커가 웨스턴 블롯으로 검출되었습니다. GM130은 조직 세포에서는 발견되었지만 sEV에서는 발견되지 않은 sEV의 음성 대조군 마커로 사용되었습니다.
효소 분해, 차등 초원심분리 및 막 여과 단계를 최대한 주의하여 수행하여 작은 세포외 소포의 순도를 보장하는 것이 중요합니다.
