우리는 기꺼이이 프로토콜을 개발한있는 기초를 제공 에릭 Wieschaus을 인정합니다. 우리 작품은 베르나 &amp; 마스 맥린 생화학 계열 분자 생물학 시작 - 업 상, 의학 베일러 대학에서 지원됩니다.

1. 엠브료 컬렉션 컵 조립 <ol><li> 가능한 한 매끄러운로 가장자리를 만들고 레이저로 100 ML 트라이 - 옥수수 비커의 바닥을 잘라. 이 절대적으로 필요한 것은 아니지만, 컵, 당신은 또한 상단에서 세 모서리를 장식하는 경우 처리하기가 쉽습니다. </li><li> 와이어 메쉬 (6cm X 6cm)의 정사각형을 잘라. 미리 예열 뜨거운 접시에, 내부 퓸 후드, 레이어 강력 알루미늄 호일의 조각 위에 와이어 메쉬의 광장. 단단히 뜨거운 메쉬에 컵 컷 아래쪽 가장자리에 밀어. 몇 초 동안 잠깐 만요, 지금 첨부 메쉬와 컵 리프트. 호일도 경우엔 그냥 풀어 껍질. </li><li> 하룻밤 잔 쿨. 미세 입자 사포와의 날카로운 가장자리에서 초과 가위로 메쉬와 모래를 제거합니다. </li></ol> 2. 애플 쥬스 아가르 번호판 확인 <ol><li> 6L 플라스크에 100g BD Bacto 아가르 및 3L 증류수를 결합. 느린 배기 설정 30 분 한천을 압력솥. </li><li> 저어 바있는 2L 플라스크에 100g의 자당, 1L 사과 주스, 그리고 6g P - Hydroxybenzoic 산성이 결합되어 있습니다. 뜨거운 접시에 감동하면서 끓는 수있는 솔루션을 열. 2 개 이상 분 동안 끓여하지 마십시오. 사과 주스의 혼합물은 냉각 후 한천로 저어 바와 함께 추가할 수있게 해줍니다. 완전히 섞는다. </li><li> 60x15 mm 배양 접시에 쏟아져 전에 60 ° C 물 목욕 시원하고에 결합 솔루션을 허용합니다. 또한, 연동 펌프는 한천을 분배하는 데 사용할 수 있습니다. 접시는 최소한 4 시간 동안은 상온을 하다니 수 있습니다. 4 얜 젖은 종이 수건과 저장소의 계층 ° C.와 Rubbermaid 용기에 스택 </li></ol> 참고 : <ul><li> 가을이나 겨울에는, 그것은 한천에 물을 추가 100 ML을 추가할 필요가있을 수도 있습니다. </li><li> 배양 접시의 브랜드는 중요하다! 만이 BD 팰컨 요리 트라이 - 옥수수 비커에 맞게. 특정 주문 정보는 아래의 자료 테이블에서 찾을 수 있습니다. </li></ul> 3. 배아의 컬렉션 컵에 GFP의 파리를 추가 <ol><li> 병를 설정하여 컬렉션의 필요에 따라 GFP의 주식을 확장 이전 영상 약 이주 날아. 파리 한 병 50 여성 30 남성 최소 하나의 배아 수집 컵 채우기 위해 일반적으로 충분 그 이상입니다. 최고의 부설 들어, 파리 (이후 부화 미만 오일 IE) 새로 eclosed해야합니다. </li><li> 대략 동등한 부품 레드 스타 활성 건조 효모와 증류수와 작은 잔을 작성하여 붙여 효모를 확인하고 효모가 해산 때까지 저어. 붙여넣기가 젖어 땅콩 버터의 대략적인 일관성해야합니다. 더 많은 효모 또는 물이 일관성을 변경 추가할 수 있습니다. 효모 붙여넣는 4에서 몇 일 동안 사용할 수 있으며, 저장해야합니다, 보상 ° C. </li><li> 효모 붙여넣기가 준비되면, 4 사과 주스 플레이트를 제거 ° C 저장합니다. 사과 주스 효모 붙여넣기와 접시, 그리고 그들이 22-25에 따뜻한 있도록 리크 ° C, 달걀이 누워 권장합니다. </li><li> 다음 반으로 다시 반으로 원형 필터 종이를 접으십시오. 8~9cm 직경을 장식하고, 쿼터 서클에서 아코디언 폴드합니다. , 동그라미를 펼쳐 그것을 반전하고, 그것이 메쉬를 접촉하기 전까지 컬렉션 컵에 넣습니다. 이 가을과 파리 호감하지 않도록 종이 컵에 안전 있는지 확인합니다. 여과지는 선택 사항이지만, 짝짓기를위한 환영 환경을 제공 않으며, 컵에 습도를 유지하고 있습니다. </li><li> 재고의 이름과 날짜와 한 잔 라벨. 부드럽게 컵 위에 거꾸로 병을 흔들어하고, 즉시 준비된 사과 주스 플레이트와 컵 커버하여 병 컬렉션에서 대회에 파리를 전송합니다. 고무 밴드와 컵 접시를 고정합니다. 직접 조명과 함께 지역의 컵 메쉬 사이드를 설정합니다. 파리는 어둠 속에서 잘하다하지 않습니다 그림자가 컵에 떨어지는 일은 없을 있는지 확인합니다. </li><li> 필요에 따라 사과 주스 플레이트를 변경합니다. 두 시간 컬렉션, 상온에서, 이미지 cellularization을 위해 잘 작동합니다. </li></ol> 4. 장착 챔버 준비 <ol><li> 배아의 장착 챔버를 준비하려면, 2~3cm 긴 양면 테이프의 조각을 잘라 슬라이드에 배치, 테이프 및 슬라이드의 긴 축을 정렬. 그들의 가장자리가 정렬되었는지 확인하고, 두 번째 2~3cm에게 양면 테이프 및 레이어 그 테이프의 다른 조각 위에 긴 조각을 잘라. </li><li> 면도날을 사용하여 슬라이드의 긴 축에 테이프와 직각의 중심에 간격이 삭감 약 3mm합니다. 채널을 만들기 위해 인하 사이의 테이프를 제거합니다. 채널에 할로 카본 27 오일의 Pipet 놓습니다. 배아가 마운트 위치를이 채널입니다. </li></ol> 참고 : <ul><li> 만이 ½ 인치의 스카치 양면 테이프는 배아를 수용할 수있는 권리 두께입니다. </li><li> 할로 카본 27 오일 산소 침투성이며, 배아 탈수를 방지하면서 있도록 산소 교환이 가능합니다. 의 굴절률로 인해, 할로 카본 27 오일도 준비에 이상적입니다및 이미징 배아. </li></ul> 5. Dechorionate 태아 <ol><li> 수집하고 dechorionate 배아하려면, 완전 잠수함 전체 표면을 위해 사과 쥬스 한천 플레이트에 충분히 50 %의 표백제를 부어. 배아들이 chorion에서 출시하는 등 전송 빛으로 자이스 혈구 검색 V8로, 해부 현미경을 사용하여보세요. 마자 chorion가 풀리고, 몇 배아 (30~60초)에서 출시로 셀 스트레이너에 표백제 및 배아를 부어. </li><li> 물총 병의 증류수로 즉시 적극적으로 스트레이너의 배아를 씻으십시오. 종이 타올에 DAB 거르는. 어떤 분홍색이 dabbing 후 수건에 볼 수있다면, 물을 배아 닦고 계속합니다. </li><li> 깨끗한 사과 주스 플레이트 (NO 효모 붙여넣기로)에 10-50 배아를 전송하기 위해 촉촉한 페인트를 사용하십시오. 종이 타월의 찢어진 가장자리로 물을 멀리 윅하고, 즉시 할로 카본 27 오일을 소량으로 배아를 커버. </li></ol> 참고 : <ul><li> Clorox의 표백제를 사용하지 마십시오. 대신, &lt;6 % 나트륨 차아 염소 산염이다 오스틴의 A - 1 상업용 표백제와 같은 브랜드를 사용합니다. </li><li> 오버 표백 또는 rinsing 불충분이 불규칙 cellularization와 죽이 배아 발생합니다. </li></ul> 6. 스테이지 및 마운트 태아 <ol><li> 전송 빛의과 해부 현미경을 사용하여 번호판의 배아 단계로 Bownes 20 형태학의 지침을 따르십시오. 포셉를 사용하여 장착 챔버의 채널에, Bownes 4 단계에 해당하는, 5 mitotic주기 11 또는 12 배아를 전송합니다. 아래 지느러미 및 복부 측면의 가시 성과 측면 사이드와 라인의 배아를 마련. 태아도 쉽게 혼자 기름이 방향으로 정렬됩니다. 커버 슬립 아래 적용되면 그들은 산소 자신의 이웃을 박탈하므로 군중의 배아 함께하지 마십시오. (그들 사이 배아 길이의 절반 남겨주세요.) </li><li> 채널의 한쪽에 양면 테이프에 미끄럼 25x25 mm 커버 중 하나 가장자리를 놓는다. 채널을 커버하는 커버 슬립을 놓습니다. 공기가 아래에 잡힌 경우, 커버 슬립의 가장자리에 할로 카본 27 오일의 작은 금액을 적용합니다. 모세관 현상은 채널에 기름을 끌어와 공기를 밖으로 밀어 것입니다. </li></ol> 참고 : <ul><li> 준비 배아에 대한 또 다른 훌륭한 자원은 다음과 같습니다 캄포스 - 오르테가, JA 및 Hartenstein, V. (1985). Drosophila melanogaster의 배아 개발. 스프링거 - Verlag, 베를린. 이 책은 더 이상 게시되지 않습니다 있지만, 사용하는 사본은 Amazon.com에 정기적으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 아껴서 할로 카본 27 석유를 사용하십시오. 이것은 장착이 쉽게됩니다. 또한 다음과 같은 이미징 단계에있는 현미경 목표에 기름 흘러 우연히 방지할 수 있습니다. </li></ul> 7. 이미지 태아 <ol><li> 여기 어떻게 진행 과정이 영상되는 세포 모양의 변화, 그리고 주소되는 질문에 의해 결정됩니다. 모든 형상 변경, 중 직립하거나 거꾸로 현미경에 장착 챔버 장소 전염 빛을하여 배아를 찾아, 그리고 관심 영역에 집중할 수 공촛점 이미지로 전환합니다. 같은 니콘의 MicroscopyU (에서 논의된 것과 공촛점 현미경에 대한 모범 사례를 준수 <a href="http://www.microscopyu.com/articles/confocal">http://www.microscopyu.com/articles/confocal</a> ). photobleaching 및 phototoxicity을 방지하기 위해, 가능한 한 작은 레이저의 파워로 생활 배아를 노출 특히 엄격한한다. </li><li> cellularization 들어, 자이스 혈구 710 레이저 스캐닝 공촛점 현미경에 이미지는 C - 고차 색지움 40x/1.2 W 코어의 목표를 ​​사용합니다. 이 현미경은 18-20에서 ° C.를 이르는 온도, 온도 제어 방 안에 보관되어 있습니다 온도 제어가 절대적으로 필요하지 않다지만, 그것은 현미경에보다되며 이미지가 더 일관성 수 있습니다. 배아의 중앙 근처에 하나의 비행기로 우리는 정기적으로 이미지, 단면의 플라즈마 막 invaginations (그림 2)를 수행합니다. 단순히 invagination 역학에 따라 들어, 30~60초 간격은 시간이 오래 경과 이미징을위한 충분한 있으며, 태아는 산소 부족이라는 명백한 증거와 함께&gt; 90 분간 영상을 견딜해야합니다. </li><li> 이미지를 인수 후, 그들은 ImageJ (라고 국립 보건원에서 프리웨어를 포함하여 이미지 분석 패키지의 임의의 숫자를 사용 분석할 수 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij을</a> ). 데이터는 다음 영화 (영화 1), 시퀀스 (그림 2) 또는 kymographs 21로 제시하실 수 있습니다. </li></ol> 참고 : <ul><li> 물이 침수 C - 고차 색지움 40x/1.2 W 코어의 목표는 배아 근처 이미징 수성 샘플 깊은 조직 이미징에 대한 aberrations을 제한 높은 개구로 인해 중간 섹션에 적합하고, 높은 해상도와 높은 형광 신호를 제공합니다. 또한,이 목표매우 긴 작동 거리 (220 μm의)을하고 있습니다. 그러나, 다른 물 또는 글리세린 침지 목표는 관심의 세포 모양의 변화는 배아의 표면 근처에 몇 군데 있습니다 특히면, 잘 수행합니다. </li></ul> 8. 다른 방법 : &quot;배아 - 접착제&quot;로 마운트 태아 <ol><li> cellularization 이외의 이미지 셀 모양 변경하려면, 그것은 쉽게 혼자 기름에 유지되지 않는 특정 방향으로 배아를 마운트 할 수 있습니다. 이렇게하려면, 이전에 설명한 것과 다른 장착 방법을 사용합니다. 섬광의 약병에 헵탄 250 μL와 양면 테이프 20cm를 결합하여 &quot;배아 - glue&quot;를함으로써 시작합니다. 섬광 nutator에 유리병이나 회전 플랫폼을 장소, 하룻밤 섞는다. </li><li> 배아 접착제에 노란색 피펫 팁을 찍어, 그리고 접착제의 흔적을 떠나, 슬라이드 따라 팁을 추적. 헵탄가 증발하는 동안, 당신은 한천의 블록에 필요한 방향으로 배아를 개최 맞춥니다. (몇 군데로 배아 표면 한천 직면한다 기억하십시오. 예를 들어, 복부 고랑 형성하는 동안 이미지 셀 모양 변경하려면, 한천을 향한 그들의 복부 측면과 배아를 탑재합니다.) </li><li> 접착제로 슬라이드를 반전하고, 부드럽게 한천 블록에있는 태아에 대한 접착제의 흔적을 누르십시오. 이제 다시 슬라이드를 반전. 배아는 해당 방향에 갇혀 것입니다. 배아의 양쪽에 양면 테이프 두 레이어를 추가, 할로 카본 27 기름을 커버하고 coverslip을 적용합니다. 위에서 설명한대로 이미지와 함께 진행합니다. </li></ol> 9. 대표 결과 : 태아가 건강하고 이미징 최적있다면, cellularization은 50-60분을해야하고, 플라즈마 막 invaginations은 진입 약 40 미크론을해야합니다. 배아는 이상 - 표백, 산소 phototoxicity에 의해 박탈되거나 손상된 경우에는, 다음 invagination도 특히 몇 군데 지역에서 느리거나 중단됩니다. 배아 건강 악화는 종종 그러한 변경 개발, 애벌레로 부화에 실패 결과. 따라서, 영상 후 분석 배아 건강에 엄격한 테스트에, humidified 챔버에 슬라이드를 유지하고 다음날 부화 살펴보십시오. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 배아 컬렉션에서 이미지로 워크플로우. 프로토콜의 흐름은 네 가지 주요 단계로 세분 수 있습니다. 첫 단계에서 모든 개인 용품 및 구성 요소가 준비하고 있으며, 다음 배아 수집 컵, 사과 주스 한천 플레이트와 GFP 파리는 배아 부설 환경을 만들어 함께 부착 할 것입니다. 두 번째 단계에서 사과 주스 한천 플레이트에 누워있는 계란과 배아가 수집됩니다. 세 번째 단계에서 배아가 플레이트에서 제거됩니다, 공연 및 장착 챔버로 이송. 네 번째 단계에서는, 탑재 배아는 공촛점 현미경에 몇 군데 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. cellularization 시간 - 저속 영상의 대표 데이터입니다. 태아는 지느러미 (D)와 명확하게 보이는 복부 (V) 측면과 함께 탑재하고 있으며, 단면의 플라즈마 막 invaginations를 수행하기 위해 중간 몇 군데 있습니다. 여기에 표시된 배아는 표현 GFP - 마이 오신 - 2 플라즈마 막 invaginations의 끝을 집중 탐사 6. 따라서 시간이 지남에 따라이 프런트의 ingression를 추적하면 플라즈마 막이 invaginates 속도를 제공합니다. 0시 분 시점은 cellularization의 발병에 해당합니다. 곧 56:00 분 시점 이후 gastrulation은 배아의 복부 측면에 시작합니다. 바 40 미크론이다. 영화 1. cellularization 시간 - 저속 영상의 대표 영화.이 영화는 2 그림에 해당합니다. cellularization의 전체 과정을 기록하기 위해 영상은 pseudocleavage 퍼로우 회귀를 캡처, 이전 mitotic주기 13에서 시작하고, gastrulation 운동은 태아의 복부 측면에서 볼 때까지 계속되었습니다. 이미지는 한 분 간격으로 수집되었다. 농도는 쉽게 gastrulation의 움직임을 볼 수 있도록 포스트 인수를 증가했다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2503/Movie%201.mov">동영상을 보시려면 여기를 클릭하세요</a> <table border="1"><tbody><tr><td> 발달 행사 및 타이밍 * </td><td> 관련 셀 모양 변경 </td><td> 질병이나 인간의 건강에 대한 링크 </td><td> 라이브 영상과 함께 최근 참고 문헌 </td></tr><tr><td> 의사 - 절단의 고랑 형성 (4; 90분 PF) </td><td> Cytokinesis </td><td> Polyploidy 및 암 진행 1 </td><td> Mavrakis 외. 2009 8 카오 외. 2010 년 9 </td></tr><tr><td> Cellularization (5; 130분의 PF) </td><td> Cytokinesis </td><td> Polyploidy 및 암 진행 1 </td><td> 카오 외., 2008 10 Sokac &amp; Wieschaus 2008 11 </td></tr><tr><td> 복부 고랑 형성, Mesoderm의 invagination (6; 180분 PF) </td><td> 혀끝의 수축, 상피 - mesenchymal 전환 </td><td> 암 전이 2 </td><td> 폭스 &amp; Peifer, 2007 12 마틴 외. 2009 13 </td></tr><tr><td> Germband 확장 (7; 195분의 PF) </td><td> 수렴 확장 </td><td> 신경 튜브 결함 3 </td><td> Bertet 외., 2004 14 블렝큰쉽 외., 2006 15 </td></tr><tr><td> Tracheogenesis (11; 320분의 PF) </td><td> 상피 튜브 형성 및 분기 </td><td> Angiogenesis 4 </td><td> Caussinus 외., 2008 16 제바 이스 &amp; 카사노바, 2010 17 </td></tr><tr><td> 도설 폐쇄 (14; 620분 PF) </td><td> 혀끝의 수축 </td><td> 상처 치유 5 </td><td> Gorfinkiel 외. 2009 18 솔론 외. 2009 19 </td></tr></tbody></table> 세포 모양 변화 표 1. 예로는 생활 플라이 배아에서 몇 군데 * Bownes 단계 번호와 시간 이후의 수정 (PF), 각 이벤트가 시작될 때, 캄포스 - 오르테가, 1985에 따라 나열되어 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 주식 플라이 </td><td> 레이블 </td><td> 원본 참조 </td></tr><tr><td> 스파이더맨 GFP (95-1) </td><td> 플라즈마 막 </td><td> 모항 외., 2001 22 </td></tr><tr><td> Resille - GFP (117-2) </td><td> 플라즈마 막 </td><td> 모항 외., 2001 22 </td></tr><tr><td> GAP43 - 비너스 </td><td> 플라즈마 막 </td><td> Mavrakis 외. 2009 8 </td></tr><tr><td> 스파게티 스쿼시 - GFP (Sqh - GFP) </td><td> 마이 오신 - 2 </td><td> Royou 외., 2002 6 </td></tr><tr><td> E - cadherin - GFP (Ecad - GFP) </td><td> 셀 - 셀 분기점 </td><td> 오다 외., 2001 23 </td></tr><tr><td> GFP - Moesin </td><td> F - 굴지 </td><td> Kiehart 외., 2000 24 </td></tr><tr><td> Utrophin - 비너스 (Utro - 비너스) </td><td> F - 굴지 </td><td> Sokac 외., 발표되지 않은 결과 </td></tr></tbody></table> 파리 배아의 이미징 세포 모양의 변화에 대한 표 2. 유용 주식

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Dev Cell. 11, 459-470 (2006).</li><li>Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip-cell+migration+controls+stalk-cell+intercalation+during+Drosophila+tracheal+tube+elongation.">Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation.</a> Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr Biol. 20, 359-366 (2010).</li><li>Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. a. r. t. i. n. e. z., A, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+global+cell+behaviour+during+dorsal+closure+in+Drosophila.">Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila.</a> Development. 136, 1889-1898 (2009).</li><li>Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+forces+timed+by+a+ratchet-like+mechanism+drive+directed+tissue+movement+during+dorsal+closure.">Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure.</a> Cell. 137, 1331-1342 (2009).</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster.">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).</li><li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization.">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

프로토콜은 여기에 개발 비행의 배아에서 세포 모양의 변화 다수의 라이브, 공촛점 이미징을 허용합니다 설명했다. 이미지에 대한 GFP 주식은 개별 연구소 (표 2)에 의해 준비하지만, 많은 이러한 주식은 인디애나 대학 (블루밍턴에서 같은 Drosophila 증권 센터로 센터에서 공개적으로 사용할 수있는 수 <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indiana.edu</a> )과 파리통 예일 대학 (앳 증권 ...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>12-550-343</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips 25x25</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (Corning #2865-25)</td>
<td>1 2-524C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Squirt bottles (H2O)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>02-897-11</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml Falcon tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (BD# 352070)</td>
<td>14-432-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bulbs for small pipets, 1 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>03-448-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scintillation vials with caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR (Wheaton #986546)</td>
<td>66021-533</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tri-Corn Beakers, 100 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>60970</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon Petri dish 60x15mm </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (BD# 351007)</td>
<td>08757 100B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (BD#352350)</td>
<td>08-771-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yellow pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ranin</td>
<td>L200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel mesh, 304, 12x24</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150-F-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass 5&frac34; inch Pasteur Pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>13-678-20B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P4 Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>09-803-6F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber bands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Max</td>
<td>A620645</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scotch double-sided tape, &frac12; inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Max</td>
<td>A8137DM-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jerry&#x2019;s Artarama</td>
<td>56460</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 Forceps High Precision Inox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Services</td>
<td>72701-DZ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR (BD #214010)</td>
<td>55411-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H 8773</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heptane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Chemical/Fisher Scientific</td>
<td>H360-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Bacto Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR (BD# 214010)</td>
<td>90000-760</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S7903</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>p-Hydroxybenzoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H5501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red Star Active Dry Yeast</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LeSaffre</td>
<td>15700</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels, C-fold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kleenex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heavy duty aluminum foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Reynolds Wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Austin&#x2019;s A-1 Commercial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100% Apple juice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Spray or Tree Top</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

imaging cell shape change in living drosophila embryos

개발 Drosophila melanogaster의 배아는 공촛점 이미징 살고 매우 의무가 아르 셀 모양 변경 번호를 겪습. 파리에서 셀 모양 변경은 더 높은 유기체에있는 사람들에게 유사하며, 그들은 조직 morphogenesis 운전. 그래서, 많은 경우에 그들의 연구는 인간의 질병 (표 1) 1-5 이해에 대한 직접적인 의미가 있습니다. 하위 세포 규모에서 이러한 세포 형태의 변화는 유전자 발현의 신호 전달, 세포 극성, cytoskeletal 개조 및 멤브레인 인신 매매에 이르기까지 활동의 제품입니다. 따라서 Drosophila의 배아들은 조직 morphogenesis 관련된으로 세포 모양의 변화를 평가할 수있는 상황뿐만 아니라를 제공뿐만 아니라 모양 세포 그 하위 세포 활동을 연구하기 위해 완전히 생리 환경을 제공합니다. 프로토콜 이미지 cellularization라는 특정 세포 모양의 변화를 위해 설계되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. Cellularization는 극적인 플라즈마 막 성장의 과정이며, 그것은 궁극적으로 세포 배반엽에 syncytial 배아를 변환합니다. mitotic주기 14 계면에서 즉, 플라즈마 막 동시에 기본 상피 세포의 시트를 생성하기 위해 ~ 6000 cortically 고정 핵의 각 주위 invaginates. 이전 제안을 카운터, cellularization는 마이 오신 - 2 수축성 6 주도 아니지만, 대신에 주로 내부 매장 7 막의 exocytosis에 의해 연료입니다. 따라서 cellularization는 cytokinesis 또는 가로 - 가느다란 관 (T - 가느다란 관) 근육의 morphogenesis로 플라즈마 막 invagination 또는 확장을 필요로 세포 모양의 변화 동안 멤브레인 인신 매매를 공부하고있는 훌륭한 시스템입니다. 이 프로토콜은 쉽게 파리 배아의 다른 세포 형태 변경의 이미지에 적용하고, 그러한 배아 컬렉션의 무대를 변경하거나, 특정 방향 (테이블에있는 배아를 탑재 &quot;배아 접착제&quot;를 사용하는 것과 약간의 adaptations을 필요로됩니다 1) 8-19. 모든 경우에 흐름은 기본적으로 (그림 1)과 동일합니다. 복제 및 Drosophila transgenesis에 대한 표준 방법은 그린 형광 단백질 (GFP) 또는 그 변종에 융합, 관심의 단백질을 표현 안정적인 비행 주식을 준비하는 데,이 파리들은 배아의 재생 소스를 제공하고 있습니다. 또는 형광 단백질 / 프로브 직접 간단 마이크로 사출 기술을 통해 90-10 플라이 배아에 도입하고 있습니다. 그런 다음, 발달 행사 및 몇 군데으로 세포 모양의 변화에​​ 따라 태아가 수집되고 해부 현미경의 형태로 개최하고, 마지막으로 위치 및 공촛점 현미경에서 시간 저속 영상에 대한 마운트.

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Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

과일 파리, Drosophila melanogaster의 조기 개발이 잘 이미징 방식에 적합 세포 모양의 변화의 숫자에 의해 특징입니다. 이 문서 Drosophila의 배아 라이브 공촛점 이미징에 필요한 기본적인 도구와 방법을 설명하며, cellularization라는 세포 모양의 변화에​​ 초점을 맞출 것이다.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

imaging-cell-shape-change-in-living-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

14.2K 조회수.  Baylor College of Medicine (BCM). 과일 파리, Drosophila melanogaster의 조기 개발이 잘 이미징 방식에 적합 세포 모양의 변화의 숫자에 의해 특징입니다. 이 문서 Drosophila의 배아 라이브 공촛점 이미징에 필요한 기본적인 도구와 방법을 설명하며, cellularization라는 세포 모양의 변화에​​ 초점을 맞출 것이다.

비디오: Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

연구

생물학

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

의 입식 이미징 Drosophila 태아

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

생활에서 보여주는 동적 Kinetochore 단백질 행동과 염색체 모션으로 Mitotic 검사 점 유학<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial 태아

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...