우리의 프로토콜은 순환 키머리즘에 대한 향상된 검증 방법과 생체 의학 연구를위한 성공적인 파라바이오시스 모델 설정을위한 방법을 제공합니다. 종종 치명적이거나 번거로운 파라바이오시스에서 혈액 키머리즘을 검출하는 기존의 방법과 비교하여, 우리의 프로토콜은 빠르고 신뢰할 수있는 검증을 허용, 안전하고 간단합니다. 이 방법은 파라바이오시스 모델에서 혈액 키머리즘의 검출에 국한되어 있지만, 파라바이오틱 시술을 수반하는 모든 생물의학 연구에 적용될 수 있다.
가장 어려운 단계는 포도당 주입입니다. 따라서 실험 절차를 수행하기 전에 꼬리 정맥 주입을 연습하거나 정맥 시각적 마우스 꼬리 고정기를 사용해야합니다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 20~25그램 마취C57 블랙 6 수컷 마우스를 supine 위치에 배치하고, 전기 면도기를 사용하여 한쪽 마우스의 왼쪽과 두 번째 마우스의 오른쪽을 팔꿈치 위 약 1센티미터에서 무릎 아래 1센티미터로 철저히 면도한다.
각 동물의 클리어 된 피부에 세로 피부 절개를하기 전에 절제 크림으로 남은 머리카락을 제거하고 팔꿈치 위 0.5 센티미터에서 무릎 관절 아래 0.5 센티미터로 시작하여 피하 근막에서 피부를 부드럽게 분리하십시오. 파라비오트의 올레크라논과 무릎을 3-0 봉합봉으로 연결하고 면도한 피부를 연속 5-0 봉합사로 봉합합니다. 그런 다음 탈수를 방지하기 위해 0.9%의 염화 나트륨0.5 밀리리터를 피하하고, 마우스 25그램당 10밀리그램의 트라마돌을 근육으로 주입하여 통증을 완화하고, 3일 동안 각 마우스에 주입합니다.
포도당 변동에 의한 파라바이오트 간의 키머리즘 간의 성공적인 순환을 확인하기 위해, 파라바이오시스 수술 후 10일째에 정맥 육각 마우스 꼬리 고정기에서 기증자 마우스를 확보하고, 70~75%에탄올에 담근 면공을 사용하여 파라비오트 꼬리의 측면에 있는 소달 정맥을 문지르게 한다. 1밀리리터 주사기 바늘을 꼬리 끝에서 2~4센티미터 의 카우달 정맥에 삽입하고 가능한 한 정맥과 평행하게 삽입하고, 10초 동안 100마이크로리터의 식염수용에 포도당 1~2그램을 주입한다. 다음으로 가위를 사용하여 기증자 및 수령인 동물로부터 발가락을 제거하여 주사 후 다양한 시점의 혈액 한 방울을 수집할 수 있습니다.
그런 다음 각 혈액 샘플 한 방울을 글루코프스터 테스트 스트립의 중앙에 추가하여 포도당 수준 검출을 합니다. 에반스 블루 염료 흡수도에 의한 순환의 성공적인 건설을 확인하기 위해, 기증자 마우스에 0.5%에반스 블루 카운터스테인의 200 마이크로리터를 주입하고, 2시간 후에 심장 천자에 의해 두 파라바이오트에서 혈액을 수집한다. 혈청을 원심분리로 분리하고, 0.9%의 염화나트륨에서 1~50비율로 희석을 위해 혈청을 원추형 튜브로 옮긴다.
그런 다음 분광계에서 620 나노미터에서 희석 된 혈청 샘플의 흡광도를 측정합니다. 6명의 기증자 마우스에 있는 혈액 포도당 수준의 이 대표적인 분석에서, 혈액 포도당은 꼬리 정맥을 통해 포도당의 100 마이크로리터의 주입 후에 1 분의 평균에 리터 당 26.5 마이크로몰라로 급격하게 증가했습니다. 혈액 포도당 수준은 60 분에 리터 당 13.3 마이크로 리터로 점차적으로 감소.
수령마우스에서는, 혈액 포도당은 주입 후에 천천히 증가하여 15 분에 첫번째 피크 수준에 도달했습니다. 파라바이오엔트의 혈청에서 에반스 블루 염료의 농도는 또한 순환 키머리즘의 성공적인 건설을 나타내고, 파라바이오엔트 사이의 피하 혈관 접합을 명확하게 관찰할 수 있었다. 파라바이오시스 수술 후 15일 간 혈액 키머리즘을 확립하지 못한 파라바이오트에서, 수혜자 마우스는 기증자 동물에 포도당 주입 후 60분 이내에 혈당 수치가 증가하지 않았다.
두 수신자에 에반스 블루의 혈액 농도도 상승 되지 않았습니다., 포도 당 변동 방법은 에반스 블루 방법으로 민감한 것을 보여주는. 더욱이 혈당은 포도당 주사 후 1시간 후 급격히 감소하여 포도당 수치가 급격히 증가하고 정상 수준으로 회복되어 인슐린 대사에 주입된 포도당의 효과를 회복할 수 있음을 나타낸다. 바늘이 꼬리 정맥에 직접 삽입되는지 확인하십시오.
이 방법에 의해 파라바이오트의 혈액 키머리즘을 확인한 후, 생리학적 변화는 살아있는 파라바이오틱 동물에서 연구될 수 있다.
