이 작업은 이스라엘 무역 노동부의 KAMIN 프로그램과 Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, US에서 자금을 지원했습니다.

이 프로토콜에서 동물의 사용은 국가 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
참고: 탄산칼슘 산호 골격은 아라고나이트의 결정 형태로 사용해야 합니다. 지금까지 신경 배양에 대해 테스트 된 산호 유형은 Porites Lutea, Stylophora Pistillata 및 Trachyphyllia Geoffroyi입니다. 해골은 전체 또는 지상으로 구입할 수 있습니다.
1. 산호 골격 조각 청소
주의 : 아래 설명된 용액은 위험하고 화상과 자극을 유발할 수 있으므로 실온의 화학 후드에서 다음 단계를 수행해야 합니다.
<ol><li>망치를 사용하여 산호 골격을 부수고 0.5-2cm 조각으로 나눕니다. 유기 및 비 유기 잔류 물을 용해시키기 위해 산호 골격 조각을 10 % 차아 염소산 나트륨 용액에 10 분 동안 담근 다음 이중 증류수 (DDW)로 한 번 씻으십시오.</li>
	<li>남아있는 유기 잔류 물을 제거하려면 1M NaOH 용액에 5 분 동안 담근 다음 DDW로 한 번 씻으십시오. 단편을 30%H2O2용액에 10분 동안 담궈 유기 침전물의 제거를 계속한 다음, 단편을 DDW로 3x 세척한다.</li>
	<li>가능한 한 많은 DDW를 제거하고 후드의 산호 조각을 건조시킵니다 (1-8 시간).</li>
</ol>2. 유리 커버슬립 청소
<ol><li>유리 커버슬립을 100mm 유리 페트리 접시에 옮깁니다. 95% 에탄올 10mL를 15분 동안 넣습니다.</li>
	<li>에탄올을 제거하고 DDW 3x로 세척하고 각 세척 사이에 10 분을 기다립니다. DDW가 증발할 때까지 80°C로 예열된 가열판에 접시를 놓습니다. 건조하는 동안 플레이트 안의 커버슬립이 서로 달라붙지 않도록 여러 번 부드럽게 저어줍니다.</li>
	<li>커버슬립을 오토클레이브합니다.</li>
</ol>3. 산호 골격 알갱이의 제조
<ol><li>산호 골격 조각을 박격포와 유봉 (수동 분쇄)을 사용하여 완전히 분해 될 때까지 분쇄하십시오. 결과는 20 μm-200 μm 범위의 입자 혼합물입니다.</li>
	<li>또는 전기 연삭기를 사용하여 30 초 동안 1,000rpm의 속도로 산호 골격 조각을 분쇄합니다 (블레이드 길이 = 6cm, 너비 = 0.5cm-1.0cm). 생성 된 입자 크기는 수동 분쇄에 의해 생성 된 크기 범위와 유사합니다.</li>
</ol>4. 특정 크기 범위의 입자 정제
알림: 매트릭스의 입자 크기를 제어하려는 경우 다음 여과 기반 입자 정제 절차를 사용하십시오.
<ol><li>곡물을 수동 또는 전기식 40μm 필터 메쉬 스트레이너로 옮깁니다.</li>
	<li>스트레이너를 통해 곡물을 체질하여 곡물을 두 개의 특정 범위로 나눕니다(전기 여과기를 사용하는 경우 다음 조건이 권장됩니다: 흔들림 = 600amplitudes/min, 바운싱 = 6/s). 이 절차는 입자 크기의 두 그룹, 즉 하나는 <40μm이고 두 번째는 >40μm입니다. 알림: 두 가지 크기는 다양한 메쉬의 스트레이너를 사용하여 결정할 수 있습니다. 더 제한된 범위가 필요한 경우 4.2 단계에서 다른 메쉬를 가진 스트레이너를 통해 각 그룹을 다시 체로 만듭니다.</li>
	<li>곡물을 고압 증기 멸균하십시오.</li>
</ol>5. 산호 곡물 코팅 접시 또는 커버 슬립의 준비
<ol><li>플라스크, 접시 또는 페트리 접시 코팅용 알림: 다음 단계는 멸균 조건에서 수행해야 합니다.<ol><li>행크스 용액에 용해 된 20 μg / mL 폴리 -D- 라이신 (PDL) 용액에 산호 골격 알갱이를 첨가합니다. 권장 농도는 PDL 용액 1mL당 곡물 5mg/10mg입니다.</li>
		<li>용액을 플라스크와 접시(약 2mL/25cm2)에 붓고 4°C에서 밤새 배양합니다. 곡물은 가라 앉고 바닥에 붙어 있습니다.</li>
		<li>다음날, 플라스크와 접시를 멸균 DDW로 한 번 씻으십시오. 플라스크와 접시를 후드에서 말리십시오. 알림: 갓 코팅된 플라스크와 접시를 사용하는 것이 좋습니다. 코팅된 플라스크 및 접시는 4°C에서 보존하면 코팅 후 최대 일주일까지 사용할 수 있습니다. 그러나 매트릭스의 효율성이 저하 될 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>코팅 유리 커버슬립(직경 12mm, 두께 0.17mm)<ol><li>원하는 농도로 DDW에 산호 골격 알갱이를 추가하십시오. 신경 세포에 사용되는 일반적인 밀도는 5mg/mL 및 10mg/mL입니다. 40μL의 곡물 용액을 커버슬립 중앙에 붓습니다(그림 4).</li>
		<li>80°C로 예열된 가열판에 커버슬립을 놓고 완전히 증발할 때까지 기다립니다(보통 15분). 이러한 조건 하에서, 곡물은 커버 슬립에 부착됩니다. 코팅된 커버슬립을 오토클레이브합니다. 멸균 상태에서 보관하십시오.</li>
		<li>배양 하루 전, 멸균 된 24 웰 플레이트의 뚜껑에 커버 슬립을 놓습니다. 각 커버슬립에 20μg/mL PDL 용액 100μL를 추가합니다. 팁을 사용하여 액체가 전체 입자 영역과 나머지 커버슬립 표면을 덮도록 합니다.</li>
		<li>접시 바닥으로 뚜껑을 덮으십시오. 플레이트의 측면을 파라핀 필름으로 감 쌉니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
		<li>다음날 DDW로 한 번 씻고 후드에서 말립니다. 알림: 갓 코팅된 커버슬립을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 산호 골격 곡물 코팅 유리 커버 슬립에서 해마 해리 세포의 배양
참고: 해마 해리 세포 배양 방법은 이전에 발표된 절차24,27에서 수정되었습니다. 배양 물의 준비는 4 마리의 쥐 새끼에 대해 설명된다. 각 해마의 예상 수율은 1-1.5 x 106 세포입니다.
<ol><li>설치<ol><li>빈 60mm 페트리 접시를 준비합니다. 최소 필수 배지(MEM) 2mL를 60mm 페트리 접시에 붓고 얼음 위에 올려 놓습니다.</li>
		<li>MEM 2mL를 35mm 접시에 붓고 37°C, 5–10%CO2의 인큐베이터에 넣습니다. 2mL의 MEM을 15mL 튜브에 붓고 4°C에서 유지합니다.</li>
		<li>First Day Medium 1mL를 15mL 튜브에 붓고 37°C, 5-10%CO2의 인큐베이터에 넣는다. 참고: First Day Medium의 구성은 재료 표에 설명되어 있습니다.</li>
		<li>2.5% 트립신 용액 200μL를 해동하고 37°C에서 배양합니다.</li>
		<li>화염을 사용하여 직경 0.5mm, 0.75mm 및 1.0mm 헤드가 있는 유리 파스퇴르 피펫 3개를 준비합니다.</li>
		<li>적절한 수술 도구를 준비하십시오 : 큰 가위 1 개, 작은 가위 2 개, 큰 핀셋 1 개, 작은 핀셋 4 개, 메스 1 개.</li>
		<li>후드에 실체 현미경을 준비하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>큰 가위를 사용하여 0-3일 된 Sprague Dawley 쥐 새끼의 머리를 몸에서 분리하여 빈 60mm 페트리 접시에 넣어 희생합니다(6.1.1단계). 시체를 처리하십시오.</li>
	<li>큰 핀셋으로 입에서 머리를 잡고 들어 올리십시오. 작은 가위로 두개골을 덮고있는 피부를 자릅니다.</li>
	<li>깨끗한 가위로 두개골 아래(소뇌 측면)로 들어가 두개골을 오른쪽과 왼쪽으로 잘라 제거할 수 있도록 합니다. 작은 핀셋을 사용하여 뇌에서 두개골을 떼어냅니다.</li>
	<li>깨끗한 핀셋으로 뇌를 머리에서 분리하고 60mL의 차가운 MEM이 들어 있는 2mm 페트리 접시에 넣습니다(6.1.2단계 참조).</li>
	<li>두 개의 작은 핀셋을 사용하여 실체 현미경으로 해마를 해부합니다. 해마를 MEM이 들어있는 준비된 35mm 접시 (6.1.2 단계)에 옮깁니다. 알림: 각 강아지에 대해 6.3–6.6단계를 반복해야 합니다.</li>
	<li>메스를 사용하여 해마를 약 1mm 조각으로 자릅니다. 트립신 용액 200 μL를 첨가한다 (0.25%의 최종 농도로 희석한다). 부드럽게 혼합하고 37 °C, 5–10 % CO2 에서 30 분 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양 후 2mL의 차가운 MEM(단계 6.1.2)을 접시에 넣어 트립신을 비활성화합니다. 트립신화된 조직을 37°C로 예열된 1 mL First Day Medium이 들어있는 15 mL 튜브로 옮기고(단계 6.1.3) 가장 큰 직경을 갖는 유리 파스퇴르 피펫을 사용한다(단계 6.1.5). 참고: 조직의 추가 처리를 위한 최상의 배지 대 조직(v:v) 비율은 1mL/8 해마입니다. 가능한 한 조직과 함께 배지를 옮기지 마십시오.</li>
	<li>조직을 가장 큰 직경의 유리 피펫에 10-15 번 통과시켜 분쇄하십시오. 그런 다음 중간 직경의 유리 피펫을 사용하여 이 과정을 반복합니다. 가장 작은 직경의 파이펫으로 연삭을 계속하십시오. 세포 사멸을 줄이기 위해 버블링을 피하십시오.</li>
	<li>나머지 조직 조각을 2-5분 동안 가라앉힌 다음 상층액을 다른 15mL 튜브로 옮깁니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 참고: 바람직한 세포 밀도는 200,000–400,000 cells/mL입니다. First Day Medium을 사용하여 희석하거나 470 x g 에서 원심분리하여 세포를 농축합니다.</li>
	<li>각 유리 커버슬립에 100μL의 세포를 시드합니다. 씨를 뿌리는 동안 전체 커버 슬립을 세포로 덮으십시오. 37 °C, 5–10%CO2에서 배양합니다.</li>
	<li>다음날, 500 μL의 뉴런 성장 배지를 웰에 첨가한다. 참고: Neuronal Growth Medium의 구성은 재료 표에 설명되어 있습니다.</li>
	<li>커버슬립을 기울여 First Day Medium을 제거하면서 핀셋을 사용하여 각 커버슬립을 적절한 웰로 부드럽게 옮깁니다. 뚜껑에서 남은 매체를 흡입합니다.</li>
	<li>37 °C, 5–10%CO2 에서 배양합니다. 배양하는 동안 배지를 교체하지 마십시오. 배양 물은 이러한 조건 하에서 최대 1 개월까지 유지 될 수 있습니다. 주요 관심사는 습도입니다. 따라서 인큐베이터를 최대한 가습 상태로 유지하십시오.</li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+skeletal+organic+matrix+from+the+stony+coral+Stylophora+pistillata.">Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).</li><li>Ramos-Silva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeletal+proteome+of+the+coral+Acropora+millepora:+the+evolution+of+calcification+by+co-option+and+domain+shuffling.">The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).</li><li>Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aragonite+crystalline+matrix+as+an+instructive+microenvironment+for+neural+development.">Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).</li><li>Morad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , (2019).</li><li>Prada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocean+warming+and+acidification+synergistically+increase+coral+mortality.">Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li></ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

여기에 제시된 기술은 배양에서 신경 세포의 유지 및 기능을 향상시키는 방법을 설명합니다. 이것은 세포를 키우고 성장과 활동을 촉진하는 산호 골격 알갱이로 만들어진 매트릭스에 세포를 부착함으로써 달성됩니다. 이 기술을 사용하면 뇌의 세포 환경을 모방하는 신경 배양 모델의 능력이 증가합니다.
배양 기질로서 매트릭스의 도입은 고전적인 신경 세포 배양 방법에 사?...

해리된 신경 세포(이 경우 해마 세포)의 배양은 높은 세포 분리 및 접근성을 제공함으로써 신경 성장 및 기능을 연구하기 위한 귀중한 실험 모델입니다 1,2,3. 이러한 유형의 배양은 성장 및 생존 속도, 신경 독성, 신경 돌기 성장 및 네트워킹, 시냅스 연결 및 가소성, 형태 학적 변형, 신경 돌기 조직 및 배선 등과 같이 수집 할 수있는 많은 양의 정보로 인해 신경 과학, 약물 개발 및 조직 공학에서 자주 사용됩니다.1,4,5,6,7.
배양의 중요성에도 불구하고, 배양 된 세포는 일반적으로 2 차원 단층의 유리 커버 슬립에서 자라도록 강요됩니다. 이러한 엄격한 환경 변형은 시간이 지남에 따라 신경 세포의 생존 능력을 크게 감소시키는데, 이는 유리 커버슬립이 접착 강도가 낮고 세포 성장을 지원하는 능력이 낮기 때문입니다 8,9,10,11.
배양된 신경 세포는 어려운 조건에서 성장해야 하기 때문에 생존을 향상시키기 위한 필수적인 접근 방식은 가능한 한 자연 환경을 모방하는 것입니다12,13. 이것은 매트릭스 역할을 하고 세포의 세포외 기질을 모방하여 조직과 같은 구조를 형성하고 영양을 공급할 수 있도록 하는 생체 재료를 사용하여 달성할 수 있습니다14.
생체 재료의 사용은 생체 적합성 스캐폴드의 역할을 하고 기계적 안정성을 제공하며 접착, 생존, 증식, 이동, 형태 형성 및 분화를 포함한 다양한 세포 특성을 향상시키기 때문에 세포 배양을 개선하는 유망한 접근 방식입니다15,16,17. 시험관 내에서 세포의 상태를 개선하기 위해 여러 유형의 생체 재료가 사용됩니다. 그 중에는 생체 고분자 또는 일반적으로 세포의 세포 외 기질의 일부인 생물학적 성분이 있습니다. 이러한 생체 재료는 주로 중합 코팅제 또는 하이드로겔의 형태로 사용된다(18,19,20). 한편, 위에서 언급한 매트릭스는 세포가 성장할 수 있는 친숙한 3D 환경을 제공하고, 접시에 대한 접착을 촉진하며, 기계적 지지를 제공합니다(21,22). 반면에, 이들의 중합 된 형태와 하이드로 겔 내 세포의 감금은 성장 배지에 존재하는 육성 성분에 대한 세포의 접근을 방해하고 또한 미세한 방법에 의한 세포의 후속 조치를 더 어렵게 만든다23.
산호 외골격은 생물학적 해양 기원 매트릭스입니다. 탄산칼슘으로 만들어졌으며 기계적 안정성이 있으며 생분해성이 있습니다. 산호 골격을 배양에서 성장하는 신경 세포의 매트릭스로 사용한 이전 연구에서는 유리 커버 슬립에 비해 훨씬 더 큰 접착력을 보여주었습니다24,25. 또한, 산호 골격에서 자란 신경 세포는 골격을 구성하는 칼슘을 섭취하는 능력을 입증했으며, 이는 영양 결핍 상태에서 신경 세포를 보호한다26. 또한, 산호 골격은 신경 세포의 생존을 증가시키고, 신경망의 형성을 촉진하고, 시냅스 연결의 속도를 높이고, 조직과 같은 구조의 형성을 가능하게하는지지 및 양육 매트릭스입니다27,28. 최근 연구에 따르면 산호 골격 매트릭스의 표면 지형은 신경교 세포의 분포와 활성화에 중요한 역할을 합니다 8,29. 또한, 산호 골격은 배양에서 골세포30,31, 간세포 및 심근 세포와 같은 다른 세포 유형의 배양을위한 매트릭스로서 효과적이다 (미공개 데이터).
따라서 산호 골격은 시험관 내에서 세포 배양을위한 유망한 매트릭스입니다. 따라서 아래에 자세히 설명 된 프로토콜은 기존 방법으로 달성 한 것보다 더 안정적이고 번영하는 신경 배양을 생산하기 위해 산호 골격에서 신경 세포를 배양하는 기술을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 심근 세포, 간세포 및 다른 세포 유형의 배양에 유용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Greiner</td><td>#60-662160</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>#17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A4503</td><td></td></tr><tr><td>D &amp;ndash; glucose</td><td>Sigma</td><td>#G8769</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Minimal Essential Eagle (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>#D5796</td><td></td></tr><tr><td>Electrical sieve</td><td>Ari Levy</td><td>#3700</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serun (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>#04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>First Day Medium</td><td></td><td></td><td>85.1% Minimum Essential Eagle&amp;rsquo;s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose.</td></tr><tr><td>Flasks</td><td>Greiner</td><td>#60-690160</td><td>25cm^2, Tissue culture treated</td></tr><tr><td>Fluoro-deoxy-uridine</td><td>Sigma</td><td>#F0503</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Menzel-Glaser</td><td>#BNCB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Romical</td><td>#007130-72-19</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Ham&#039;s F-12 Nutrient Mixture</td><td>Sigma</td><td>#N4888</td><td></td></tr><tr><td>HANK&#039;S solution</td><td>Sigma</td><td>#H6648</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma</td><td>#K3375</td><td></td></tr><tr><td>L - glutamine</td><td>Sigma</td><td>#G7513</td><td></td></tr><tr><td>Manual strainer (40&amp;micro;m)</td><td>VWR</td><td>#10199-654</td><td></td></tr><tr><td>Minimun Essential Eagle (MEM)</td><td>Sigma</td><td>#M2279</td><td></td></tr><tr><td>Mortar and pestle</td><td>De-Groot</td><td>4-P090</td><td></td></tr><tr><td>NaClO (Sodium Hypochlorite)</td><td>Sigma</td><td>#425044</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>#S8045</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Neuronal Growth Medium</td><td></td><td></td><td>45% MEM, 40% Dulbecco&#039;s modified eagle&#039;s medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine.</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Greiner</td><td>#60-628160, #60-627160</td><td>60mm, 35mm, respectively.</td></tr><tr><td>Poly D &amp;ndash; Lysine</td><td>Sigma</td><td>#P7280</td><td></td></tr><tr><td>Smart Dentin Grinder</td><td>KometaBio</td><td>#GR101</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>#15-090-046</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>#U3750</td><td></td></tr></tbody></table>

increasing durability of dissociated neural cell cultures using biologically active coralline matrix

해리된 해마 신경 세포 및 신경교 세포의 배양은 높은 세포 격리와 통제된 환경을 제공함으로써 신경 성장 및 기능을 연구하기 위한 귀중한 실험 모델입니다. 그러나, 시험관 내에서 해마 세포의 생존은 손상된다 : 대부분의 세포는 배양 첫 주 동안 죽는다. 따라서 배양에서 신경 세포의 내구성을 높이는 방법을 식별하는 것이 매우 중요합니다.
산호의 골격에서 유래 한 결정질 아라고나이트 형태의 탄산 칼슘은 신경 배양을위한 우수한 활성 매트릭스로 사용될 수 있습니다. 신경교 세포를 육성, 보호 및 활성화함으로써 산호 골격은 다른 매트릭스보다 시험관 내에서 이러한 세포의 생존과 성장을 더 잘 향상시킵니다.
이 프로토콜은 산호 매트릭스에서 해마 세포를 배양하는 방법을 설명합니다. 이 매트릭스는 산호 골격 알갱이를 배양 접시, 플라스크 및 유리 커버 슬립에 부착하여 생성됩니다. 곡물은 세포를 미세한 3차원(3D) 환경에 도입하여 성장하고 조직과 같은 구조를 형성함으로써 세포의 환경을 개선하는 데 도움이 됩니다. 산호 골격에 의해 도입 된 3D 환경은 분쇄를 통해 세포에 최적화 될 수 있으며, 이는 신경교 세포 활동에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 특성 인 입자의 크기와 밀도 (즉, 매트릭스 거칠기)를 제어 할 수 있습니다. 또한, 곡물을 사용하면 특히 광학 현미경을 사용할 때 배양을 더 쉽게 관찰하고 분석할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜에는 시험관 내에서 신경 세포의 유지 및 기능을 개선하기 위한 도구로서 산호 매트릭스의 생성 및 최적화를 위한 절차가 포함됩니다.

산호 골격 매트릭스를 준비하기 위해 전체 산호 골격 (그림 1A)을 망치 (그림 1B)를 사용하여 0.5-2cm 조각으로 나누고 10 % 차아 염소산염 용액, 1M NaOH 용액 및 30 % H 2 O2용액 (그림 1C)을 사용하여 3 단계 (프로토콜의 1 단계)를 통해 유기 잔류 물로부터 철저히 세척했습니다. 산호 조각은 골격 색이 갈색 (?...

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Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

해리 된 해마 세포 배양은 신경 과학에서 중추적 인 실험 도구입니다. 산호 골격이 신경 보호 및 신경 조절 역할로 인해 매트릭스로 사용될 때 배양에서 신경 세포 생존과 기능이 향상됩니다. 따라서 산호 기질에서 자란 신경 세포는 더 높은 내구성을 나타내므로 배양에 더 적합합니다.

생물학적 활성 Coralline Matrix를 사용한 해리 된 신경 세포 배양의 내구성 향상

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

increasing-durability-dissociated-neural-cell-cultures-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

1.3K 조회수.  Ariel University. 해리 된 해마 세포 배양은 신경 과학에서 중추적 인 실험 도구입니다. 산호 골격이 신경 보호 및 신경 조절 역할로 인해 매트릭스로 사용될 때 배양에서 신경 세포 생존과 기능이 향상됩니다. 따라서 산호 기질에서 자란 신경 세포는 더 높은 내구성을 나타내므로 배양에 더 적합합니다.

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Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

연구

생체공학

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

신경과학

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the mature Schwann cell fate. We subjected rat and human MSCs to transient hypoxic conditions (1% oxygen for 16 h) followed by expansion as neurospheres upon low-attachment substratum with epidermal growth factor (EGF)/basic fibroblast growth factor (bFGF) supplementation. Neurospheres were seeded onto poly-D-lysine/laminin-coated tissue culture plastic and cultured in a gliogenic cocktail containing &#946;-Heregulin, bFGF, and platelet-derived growth factor (PDGF) to generate Schwann cell-like cells (SCLCs). SCLCs were directed to fate commitment via coculture for 2 weeks with purified dorsal root ganglia (DRG) neurons obtained from E14-15 pregnant Sprague Dawley rats. Mature Schwann cells demonstrate persistence in S100&#946;/p75 expression and can form myelin segments. Cells generated in this manner have potential applications in autologous cell transplantation following spinal cord injury, as well as in disease modeling.

Marrow stromal cells (MSCs) with neural potential exist within the bone marrow. Our protocol enriches this population of cells via hypoxic preconditioning and thereafter directs them to become mature Schwann cells.

성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

발생학

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide suffering from corneal vision loss1. To address the demand for viable human corneas, significant progress in three-dimensional (3D) tissue engineering has been made2,3,4. These cornea models range from simple monolayer systems to multilayered models, leading to 3D full-thickness corneal equivalents2.
However, the use of a 3D tissue-engineered cornea in the context of in vitro disease models studied to date lacks resemblance to the multilayered 3D corneal tissue structure, function, and the networking of different cell types (i.e., nerve, epithelium, stroma, and endothelium)2,3. In addition, the demand for in vitro cornea tissue models has increased in an attempt to reduce animal testing for pharmaceutical products. Thus, more sophisticated models are required to better match systems to human physiological requirements, and the development of a model that is more relevant to the patient population is absolutely necessary. Given that multiple cell types in the cornea are affected by diseases and dystrophies, such as Keratoconus, Diabetic Keratopathy, and Fuchs, this model includes a 3D co-culture model of primary human corneal fibroblasts (HCFs) from healthy donors and neurons from the SH-SY5Y cell line. This allows us for the first time to investigate the interactions between the two cell types within the human corneal tissue. We believe that this model could potentially dissect the underlying mechanisms associated with the stromal-nerve interactions of corneal diseases that exhibit nerve damages. This 3D model mirrors the basic anatomical and physiological nature of the corneal tissue in vivo and can be used in the future as a tool for investigating corneal defects as well as screening the efficacy of various agents before animal testing.

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

This protocol describes a novel three-dimensional in vitro model, where corneal stromal cells and differentiated neuronal cells are cultured together to assist in the examination and understanding of the interactions of the two cell types.

각 막 조직 공학:는 생체 외에서 의 모델 인간 각 막의 실질 신경 상호 작용

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular matrix (osteoid) express the Pdpn gene to form cellular dendrites and transform into preosteocytes. Later, preosteocytes express the Dmp1 gene to promote matrix mineralization and thereby transform into mature osteocytes.This process is called osteocytogenesis. IDG-SW3 is a well-known cell line for in vitro studies of osteocytogenesis. Many previous methods have used collagen I as the main or the only component of the culturing matrix. However, in addition to collagen I, the osteoid also contains a ground substance, which is an important component in promoting cellular growth, adhesion, and migration. In addition, the matrix substance is transparent, which increases the transparency of the collagen I-formed gel and, thus, aids the exploration of dendrite formation through imaging techniques. Thus, this paper details a protocol to establish a 3D gel using an extracellular matrix along with collagen I for IDG-SW3 survival. In this work, dendrite formation and gene expression were analyzed during osteocytogenesis. After 7 days of osteogenic culture, an extensive dendrite network was clearly observed under a fluorescence confocal microscope. Real-time PCR showed that the mRNA levels of Pdpn and Dmp1 continually increased for 3 weeks. At week 4, the stereomicroscope revealed an opaque gel filled with mineral particles, consistent with the X-ray fluorescence (XRF) assay. These results indicate that this culture matrix successfully facilitates the transition from osteoblasts to mature osteocytes.

Here, we present a protocol for culturing IDG-SW3 cells in a three-dimensional (3D) extracellular matrix.

IDG-SW3 3차원 세포외 기질에서의 세포 배양

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...

Co-Culture of Schwann Cells with DRG Neurons on a Pre-Stretched Membrane

Source: Liu, C., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54085">An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
The video demonstrates the co-culturing of dorsal root ganglion (DRG) neurons with Schwann cells. DRG neurons are first grown on a pre-stretched membrane for aligned axon growth. Schwann cells are then introduced, which attach to the axons, insulating them and promoting neural cell survival and function.

Pre-Stretched Membrane에서 Schwann 세포와 DRG 뉴런의 공동 배양

1. Culture of dorsal root ganglion (DRG) on Pre-stretched Surface

	Preparation of Pre-stretched Anisotropic Surface
	
		Mix a 10:1 solution of base and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuronal Culture Techniques

Co-culture and Interaction Studies

Generating a 3D Co-Culture Model of Human Corneal Fibroblasts and Neurons

Source: Sharif, R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56308">Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a technique to generate a three-dimensional co-culture model system of primary human corneal fibroblasts and differentiated neuronal cells. This co-culture system can be used to study the stromal-nerve interactions.

인간 각막 섬유아세포와 뉴런의 3D 공동 배양 모델 생성

1. Primary HCFs (human corneal fibroblasts) Culture and 3D Constructs Assembly

	To assemble 3D constructs from explants previously grown in EMEM 10% FBS ...

Preparation of Collagen-Coated Compartmented Culture Dishes for Neuronal Cell Culture

Source: Zepecki, J. P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59744">Real-Time monitoring of human glioma cell migration on dorsal root ganglion axon-oligodendrocyte co-cultures.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates constructing a three-compartment cell culture system using collagen and non-reactive grease. This system is used to observe interactions between glioma cells and axons in real-time.

신경 세포 배양을 위한 콜라겐 코팅 구획 배양 접시의 준비


	Compartmented culture of Rat Dorsal Root Ganglia (DRGs), Oligodendrocytes (OPCs), and hGCs (human glioma cells)

1. Preparation of compartmented culture ...