골형성을 통한 형성 및 유전자 발현을 분석하기 위해 콜라겐과 함께 세포외 지표를 사용하여 3D 시스템을 구축하기 위한 프로토콜을 자세히 설명했습니다. 세포외 측정법은 콜라겐 단형 겔의 투명도를 높일 수 있으며 이미징 기술을 위한 수상돌기 형성을 탐색하는 데 적합합니다. 시작하려면 0.9ml의 기저막 매트릭스를 얼음 위의 새 15mlL 원심분리기 튜브에 천천히 피펫팅하고 따로 보관합니다.
다음으로, 인큐베이터에서 인터페론 감마가 보충된 4밀리리터의 완전한 배지에서 IDG SW3 배양 세포의 T25 치실을 제거합니다. 배양 배지를 제거한 후 피펫으로 PBS pH 7.4로 세포를 세척합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 30초 동안 0.5밀리리터의 0.25% 트립신 EDTA로 세포를 트립산화합니다.
3.5 밀리리터의 완전한 배지를 추가하여 트립신을 비활성화하십시오. 섭씨 4밀리리터의 연금을 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 300G의 셀 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 회전시킵니다.
상층액을 버린 후 셀 팔레트를 얼음 위에 완전한 배지 1밀리리터에 재현탁시킵니다. 혈세포분석기를 사용하여 세포를 계수하고 완전한 배지로 최종 세포 밀도를 밀리리터당 4배 10에서 5번째 세포로 조정합니다. 제조된 세포 현탁액 0.1mL를 얼음 상에 보관된 세포외 기질 0.9mL에 첨가한다.
위아래로 부드럽게 피펫팅하여 잘 섞습니다. 세포 매트릭스 혼합물 1mL와 미리 준비한 콜라겐 혼합물 1mL를 얼음 위에서 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다. 최종 혼합물 0.5mL를 24웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 셀 겔 혼합물을 형성합니다.
배양 후 각 웰의 세포 겔 혼합물에 0.5mL의 골형성 배지를 추가합니다. 섭씨 37도에서 골형성 분화를 시작하려면 이 날을 0일로 간주하십시오. 이틀에 한 번씩 배지의 절반을 신선한 골형성 배지로 교체하고 35일 동안 배양을 계속합니다.
냉동실에서 칼슘 AM과 에티듐 원 원액을 꺼내 실온으로 데우십시오. 2 밀리 몰 에티듐 1 원액 4 마이크로 리터와 4 밀리 몰 칼슘 AM 원액 5 마이크로 리터를 2 밀리리터의 DPBS에 첨가하고 잘 혼합하여 2 마이크로 몰 칼슘 AM 및 4 마이크로 몰 에티듐 1을 작동 용액으로 얻습니다. 배양 1일차 및 7일차에 세포 염색을 수행하려면, 0.5mL의 작업 용액을 24웰 플레이트의 웰에 피펫팅하고 실온에서 30 내지 45분 동안 배양하여 세포 겔 매트릭스를 염색합니다.
약 0.5ml의 신선한 DPBS를 새로운 35mm 유리 바닥 배양 접시에 넣고 접시를 덮어 샘플의 오염 또는 건조를 방지합니다. 팔꿈치 끝이 있는 겸자를 사용하여 세포 겔 매트릭스를 손상시키거나 전단하지 않고 염색된 세포 겔 매트릭스를 배양 접시가 들어 있는 DPBS로 조심스럽게 옮깁니다. 레이저 컨포칼 형광 현미경으로 라벨링된 세포를 볼 수 있습니다.
염색된 세포 겔 매트릭스가 들어 있는 배양 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 10x 대물렌즈를 사용하여 접안렌즈를 통해 스캔할 세포 겔 매트릭스 영역을 선택합니다. 현미경 스캔을 설정하려면 광학 필터를 선택합니다.
칼슘은 표준 형광 밴드 통과 필터가 있는 녹색으로, 에티듐은 프로피듐 요오드화물 또는 텍사스 적색 염료용 필터가 있는 빨간색으로 볼 수 있습니다. 스캔할 라인 모드를 선택한 다음 획득 모드를 클릭하여 공기 단위를 1au로 설정합니다. 8비트 데이터 심도와 1024 x 1024 픽셀의 이미지 해상도를 선택합니다.
그런 다음 라인 단계를 선택하고 스캔 속도를 5로 설정합니다. 이미지의 Z 스택을 수집하려면 녹색 채널 신호에 따라 연속적으로 스캔하면서 샘플을 통해 초점을 맞춰 스캔할 세포 겔 매트릭스의 상단 및 하단 위치를 정의합니다. 샘플의 상단과 하단이 지정되면 원하는 스캔 프레임을 선택하고 스캔을 시작합니다.
샘플은 선택한 설정으로 위에서 아래로 스캔되어 이미지 갤러리를 생성합니다. 생존 가능한 세포를 식별하려면 하나의 이미지 슬라이스를 선택합니다. 녹색 및 빨간색 채널은 각각 살아있는 세포와 죽은 세포를 나타냅니다.
세포 수상돌기를 식별하려면 단일 녹색 채널을 선택하여 이미지 수집 소프트웨어로 3D 재구성을 생성하면 일련의 무지개 의사 색상 이미지가 깊이 정보를 나타냅니다. 아래쪽에 있는 수상돌기는 빨간색으로 표시되고 위쪽에 있는 수상돌기는 파란색으로 표시됩니다. 배양하는 날이 다르면 배양 배지를 제거하고 DPBS로 플레이트의 겔을 두 번 세척합니다.
DPBS의 0.5밀리리터 또는 4% 파라포름알데히드를 웰에 추가하여 실온에서 10분 동안 플레이트에 세포 겔 매트릭스를 고정합니다. 웰에서 파라포름알데히드를 제거하고 이전에 설명한 대로 플레이트에 DPBS로 셀 겔 매트릭스를 두 번 더 세척하고 이미징을 위해 각 웰에 0.5밀리리터의 DPBS를 남겨 둡니다. 스테레오 현미경 스테이지에 플레이트를 놓고 0.5x 대물렌즈를 사용하여 접안렌즈를 통해 최적의 위치를 선택합니다.
이미지, 명시야 하에서 자동 노출을 사용하여 플레이트에 있는 세포 겔 매트릭스의 전체 시야 보기. 배양 35일째에 액체 질소 수준을 확인하고 XRF 시스템을 시작합니다. 샘플 룸을 열고 팔꿈치가 기울어진 겸자가 있는 겔을 플레이트에서 기기의 샘플 스테이지 중앙으로 옮깁니다.
샘플 룸을 닫고 기기가 식을 때까지 30분 동안 기다렸다가 사용하십시오. 노출 시간을 35밀리초로 설정합니다. 스펙트럼 범위는 0에서 40 킬로 전자 볼트까지, 전류는 770 마이크로 암페어입니다.
시료 스테이지를 이동하면서 분석을 위해 3-5개의 스캐닝 부위를 선택합니다. 칼슘과 인 원소를 선택하십시오. 검색을 시작하고 결과를 내보냅니다.
다른 경작의 날에. 배양 배지를 제거한 세포 겔 매트릭스를 얼음처럼 차가운 DPBS로 두 번 세척합니다. 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 방법을 사용하여 세포 겔 매트릭스에서 총 RNA를 추출합니다.
그런 다음 무작위 헥사머 프라이머를 사용하여 총 RNA 2마이크로그램을 CDNA로 역전사합니다. 튜브를 thermocycler에 놓고 PCR 증폭을 수행합니다. PCR 후 2 델타 CT 방법으로 접힘 변화를 분석합니다.
컨포칼 레이저 현미경으로 시각화한 살아있는 죽은 세포 염색은 모든 세포가 칼슘 AM 양성이고 에티듐 원 양성 세포가 거의 없음을 보여주었으며, 이는 겔 시스템이 골세포 형성에 매우 적합함을 나타냅니다. 세포 수상돌기는 점차적으로 7일째에 골형성 배지의 네트워크로 확장되었습니다. 7일차 배양물의 유사 컬러 이미지는 겔의 바닥과 상단에서 서로 다른 깊이의 세포 안드로이드를 보여줍니다.
표시된 시간에 24웰 플레이트에서 세포가 있는 겔과 세포가 없는 겔의 전체 필드 이미지가 이미지화됩니다. 겔 매트릭스의 투명도는 cell-free 겔 매트릭스와 달리 35일째에 불투명해질 때까지 계속 감소했습니다. 35일째 되는 날 불투명 겔의 XRF 스펙트럼은 겔이 칼슘과 인 침전물로 완전히 채워져 있음을 나타냈습니다.
Real-Time PCR로 분석한 여러 마커 유전자의 발현은 포도플라닌과 상아질 매트릭스 단백질 1의 mRNA 수치가 1일차부터 21일차까지 지속적으로 증가하고, 21일차 이후에는 mRNA 수치가 감소하는 것을 보여주었습니다. 섬유아세포 성장 인자 23과 스클레로스틴의 mRNA 수준은 모든 단계에서 지속적으로 증가했습니다. 콜라겐 하나와 기저막 메트릭은 빠르게 겔화되고 실온입니다.
따라서 사용되는 모든 팁과 튜브는 달리 명시되지 않는 한 미리 냉각되어야 합니다. 이미징 기술로 골형성 중 흥미로운 이벤트를 관찰할 수 있습니다. 수상돌기 형성 및 신장 동안 분자 작용을 국소화하는 것이 더 쉽습니다.
