이 실용적이고 재현 가능한 방법은 그대로 마우스 내에서 백혈구 모집으로 이어지는 내피성 백혈구 상호 작용을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 또한 생체 내에서 백혈구 모집 폭포 내에서 생리및 병리학 적 과정의 모니터링을위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 방법은 상이한 염증 및 정화조 모델에 적용될 수 있다.
예를 들면, 우리는 최근에 과장된 근육 백혈구 침투를 관련시키는 근육병증의 연구 결과에 있는 그것의 관련성을 강조했습니다. 이 기술을 사용하는 것을 고려하고있는 동료 과학자들에게 우리의 제안은 방법이 사소한 편차에 매우 취약할 때 가능한 한 많은 실습 경험을 얻는 것입니다. 절차를 보여주는 사이먼 크라니그, 내 실험실에서 임상의 및 수석 과학자 될 것입니다.
마취된 실험 동물의 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 37°C의 섭씨 가열 패드에서 등쪽 재림 자세로 마우스를 고정하고 흡수할 수 없는 멸균 6-0 봉합사를 사용하여 정면 치아 주위에 간단한 루프를 감습니다. 봉합사의 결합 끝을 가열 패드에 테이프로 사용하고 핀셋을 사용하여 중간라인에서 피부를 부드럽게 들어 올립니다. 다음으로, 목과 상부 흉부 위에 1~2센티미터 직경 절개를 하고 핀셋을 사용하여 주변 근육, 지방 및 결합 조직을 조심스럽게 해부합니다.
기관 아래에 봉합사를 놓습니다. 작은 수술 가위를 사용하여 약 1.3mm의 횡반을 기관으로 자르고 상부 기도를 확보하기 위해 기관의 caudal 끝에 폴리에틸렌 튜브를 도입하십시오. 하나의 원형 매듭 봉합사로 위치한 튜브를 수정하고 기관의 오른쪽을 따라 경동맥을 찾습니다.
경동맥 벽에서 주변 조직을 해부하고 동맥 아래에 봉합사의 두 조각을 전달합니다. 첫 번째 두개골 봉합사 근위를 경동맥의 양면에 묶고 두 번째 봉합사를 묶지 않고 첫 번째 봉합사에서 약 5~8밀리미터 의 결산한다. 다음으로, 30센티미터 분량의 폴리에틸렌 튜빙을 식염수로 채워진 1밀리리터 주사기 바늘에 부착하고 7mm 용기 클립을 사용하여 경동맥을 두 번째 봉합사에 분해합니다.
경동맥에서 약 0.5mm 의 횡반절단을 만들고 멸균 폴리에틸렌 튜브를 동맥에 도입한다. 두 번째 봉합사로 튜브를 고정하고 선박 클립을 제거합니다. 그런 다음 주사기 플런저를 부드럽게 우울하여 식염수를 용기에 넣습니다.
크레마스터 근육을 준비하려면 현미경 단계를 향한 음낭이있는 맞춤형 플라스틱 현미경 프레임으로 마우스를 옮기고 핀셋으로 가장 황당한 끝에 음낭을 조심스럽게 잡습니다. 음낭을 부드럽게 당기고, 음낭 피부의 직경 약 5밀리미터 의 원형을 제거하여 열린 조직을 식염수로 잘 수화합니다. 두 개의 핀셋을 사용하여 느슨한 결합 조직을 해부하고 두 고환을 모두 찾습니다.
하나의 고환을 분해하고 부드럽게 단계별로 주변 결합 조직을 제거 생식 조직을 당겨 시작합니다. 고환이 외부화되면 조직의 단부 끝을 스테이지를 둘러싼 고무 링에 고정하고 식염수로 조직을 수화시합니다. 다음으로, 조심스럽게 기본 크레마스터 근육을 해치지 않고 결합 조직을 제거합니다.
근본적인 크레마스터 근육을 해치지 않고 흐릿한 심상을 초래할 모든 결합 조직을 제거하는 것이 중요합니다. 조직의 모든 제거 된 경우, 조직의 근위 끝에 매우 단개절을 만들기 전에 크레마스터 근육을 열기 위해 1 밀리미터 횡절개를합니다. 근육은 구형적으로 열립니다.
조심스럽게 유리 단계에 근육을 확산하고 조직의 중앙 부위를 만지거나 해치지 않도록주의고무 링에 근육을 고정. 그런 다음 나머지 고환을 측면에 고정하여 관심 영역에 대한 액세스를 제공하고 PSS로 조직을 수화합니다. 근육 혈관의 인트라베이티 시각화를 위해 장착된 크레마스터 근육을 수직 현미경에 배치하고 40X 목표를 선택합니다.
현미경의 직립 목표에 테이프로 붙인 작은 튜브를 통해 35~37도의 연속 슈퍼퓨전 하에서 연속 적인 슈퍼퓨전하에서 기록을 수행하여 근육과 조직에 대한 목표와 함께 PSS의 연속 투하를 허용합니다. 모세혈관 후 정맥을 식별합니다. 직경 20~40마이크로미터의 정맥의 미세 순환을 측정합니다.
그런 다음 30초 동안 크레마스터 근육으로부터의 미세 순환의 고해상도 이미지를 기록하여 근육 조직의 수축 및 이완의 약간의 변화로 인해 지속적으로 초점을 조절한다. 과잉 결합 조직은 흐릿한 현미경 심상으로 이끌어 낼 수 있습니다. 이 대표적인 현미경 이미지에서, 직경이 20 내지 40 마이크로미터 사이여야 하는 모세관 후 정맥은 두 개의 작은 혈관의 합류에 의해 규명될 수 있다.
백혈구를 순환하는 동안 부착 및 롤링 백혈구는 녹화 된 비디오의 슬로우 모션 리플레이에서만 추적 할 수 있습니다. 다양한 파라미터는 심장 출력, 혈관 직경, 중심 속도, 벽 전단 속도 및 순환 백혈구 수를 포함하여 생체 내 백혈구 모집에 영향을 미칠 수 있다. 중심선 속도는 심장 출력, 말초 혈관 저항 및 인트라바살 부피의 영향을 받습니다.
예를 들어, 경동맥 카테터를 통해 주어진 로다민 또는 다른 실험 물질의 큰 양은 모세혈관 후 중심속도 증가시키고 백혈구 포획 및 압연을 억제한다. 반대로, 심장 부전, 심층 마취, 또는 저체온증은 모세관 후 흐름을 감소시킬 수 있다. 중심선 속도를 결정하기 위해, 자유롭게 순환하는 형광 백혈구가 사용될 수 있거나 백혈구는 로다민과 같은 형광 시약으로 염색되어야 합니다.
야생 형 균주는 생리적 차이를 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, C57BL/6 마우스는 C57BL/10ScSn 동물에 비해 명확하게 향상된 백혈구 압연, 접착 력 및 환원을 나타낸다. 계획 및 표준화 단계는 현미경 검사법에 대한 크레마스터 근육의 준비 중에 특히 기술을 마스터하는 데 중요합니다.
백혈구 모집을 시각화하는 다른 방법은 추가 정보를 산출하고 채용 캐스케이드에 백혈구 및 내피 세포의 개별 기여를 해부하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 약리명상제와 새로운 면역 조절 물질의 전임상 평가를 위한 플랫폼을 제공합니다.
