세포 격리 후 전체 프로토콜은 약 2 시간 소요됩니다. 1. 미세 수술 준비 <ol><li> 9,12은 세포가 동물의 동작을 행하는 시간 동안 휴식을 허용하는 표준화 된 프로토콜에 따라 도너 골수 및 절연 모집단의 형광 라벨링에서 줄기 세포 분리를 수행한다. 형광 표지를 위해 우리는 CFDA (카르복시 디 아세테이트 숙신 이미 딜 에스테르)를 추천합니다. </li><li> 케타민 (75 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (2.5 ㎎ / ㎏) 20-25 g의 무게 남성 마우스를 마취. (일반적으로 매일 30 ~ 60 분) 필요에 따라 수술 및 실험 프로토콜을 통해, 마취 보조제로 (초기 주입의 10 %, IP)을 유지해야한다. </li><li> 부드럽게 오른쪽 음낭의 앞쪽 측면뿐만 아니라 오른쪽 허벅지와 사타구니를 면도. 모든 적신 면봉으로 머리를 잃을 수집합니다. 플렉시 글라스 시청 무대에서 마우스 복부 측면을 배치하고 수수료를 수정탄력있는 주름을 사용하여 t. 무대는 다리와 음낭 모두 상승의베이스 플레이트의 꼬리 가장자리에베이스 플레이트와 제 2 플레이트로 구성, 맞춤 제작된다. 37 ℃의 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 스테이지를 놓고 스테이지에 고정 후, 조작 현미경 동물을 배치하고 (10)를 사용하여 다음의 조작을 수행하는 단계 - 16 배 배율로. </li><li> 사타구니까지 오른쪽 허벅지, 무릎에서 대퇴 혈관의 바로 앞쪽에 피부 가위를 사용하여 초기 절개를합니다. </li><li> 대퇴 동맥을 확인하고 주위 조직에서 동맥을 동원, 근위를 따릅니다. 확인하고 thermocautery 사용하여 왼쪽 고환에 큰 가지를 잘라. 그 후 왼쪽 고환에 표면적으로 숙박 봉합을 배치합니다. 부드러운 견인은 대퇴 동맥의 추가 근위 동원을 용이하게합니다. </li><li> 근위 동원 종료 후, 식별하고 대규모 분기 실행 mediall 컷thermocautery에 의해 허벅지에 y를 입력합니다. 그 후 오른쪽 허벅지의 말단 부분에있는 대퇴 동맥을 결찰. 합자에 부드러운 견인 더 준비를 도움이됩니다. </li><li> 다시 근위 대퇴 동맥에 지금 관심을 뒤집어 근위 가능한 동맥 주위의 봉합을 배치합니다. 매듭을 준비했지만 아직 묶어하지 않습니다. 봉합에 부드러운 견인을 적용하고 동맥 꼬임을 만들 수 있습니다. </li><li> 꼬임을 설정 한 후, 동맥 신중 microscissor을 사용하고 절개. 대퇴 정맥이 손상되지 않도록 특별한주의를 기울입니다. </li><li> 절개를 통해 준비된 microcatheter (내경 0.28 mm)를 삽입합니다. 카테터 (0.9 % 염화 나트륨, 염화나트륨)을 탈기하고 1 ㎖ 주사기 삽입 이전에 연결되어야한다. </li><li> 카테터의 성공적인 삽입 후, 정중 카테터의 통과를 용이하게하기 위하여 꼬임을 풀어. 동맥 혈류량은 카테터 내에 즉시 볼 수 있어야한다. 부드럽게 카테터를 몇 밀리미터를 진행이전 꼬임 이후의. 그 후, 카테터의 고정을위한 준비 합자를 묶어. </li><li> 부드럽게 정확한 위치를 확인하기 위해 카테터 (0.9 % 염화나트륨)과 대기음을 세척하십시오. 추가 작업 단계에 카테터를 확보하기 위해 테이프의 조각을 사용합니다. </li><li> 적절한 고정 후, cremaster 근육의 다음과 같은 준비 단계를 따로 카테터를 넣어. 혈전 형성을 방지하기 위해 정기적 인 세척 및 카테터마다 5 ~ 10 분의 열망을 적용합니다. </li><li> 오른쪽 음낭에 지금 관심을 켜고 오른쪽 음낭의 복부 측면 위의 피부와 근막을 절단하여 절개를합니다. 모든 악기와 기본 조직을 건드리지 않도록주의하십시오. </li><li> 최대 사타구니 배와 꼬리 쪽 음낭의 말단부에 절개를 확장합니다. </li><li> 그것을 건드리지 않고 cremaster 자루 위를 조심스럽게 분리 기본 부드러운 결합 조직. cremaster의 말단부를 식별하고, SL 여기 숙박 봉합을 배치ightly 근육을 확장 할 수 있습니다. 부드럽게 꼬리 쪽과 앞쪽 근육을 당겨 근육 자루 아래에 지금 남아있는 연부 조직을 절제. </li><li> 결합 조직에서 완전히 분리 한 후, 가위를 사용하여 두개골 가장자리에 한 지점에서 cremaster의 자루를 엽니 다. 근육의 선단이 개방 아래에서 절개를 확장합니다. </li><li> 그 후 가위를 사용하여 근육과 고환 사이의 나머지 연결을 절단, thermocautery 사용하여 고환과 cremaster를 연결하는 작은 용기를 밀봉. </li><li> 현미경 필드 중에 고환을 옆으로 누워. </li><li> 열린 cremaster 이제 무대에 평평. cremaster 근육 조직을 확산하기 위해 조직의 가장자리에 네 6-0 Prolene으로 숙박 봉합을 배치하고 탄력있는 주름으로 수정합니다. 지금부터 연속적으로 1 ㎖ 주사기 (도 1)를 사용하여 인산염 완충 식염수 (PBS)로 조직을 적실. </li><li> 지금 15 분 동안 휴식을 준비 할 수 있습니다. 그 후 주입미세 혈관의 콘트라스트 향상을위한 좌측 대퇴 동맥을 통해 1 % 로다 민 - 덱스 트란의 0.05 ~ 0.1 ML. 어떤 케모카인이나 염증성 에이전트가 응용 프로그램에 대한 계획하는 경우, 당신은 지금 화제로 1 ML의 주사기를 사용하여 각각의 시약과 근육을 습하게한다. 대조 실험의 경우, PBS로 가습 계속. </li></ol> 2. 의 intravital 현미경 <ol><li> 가동 스테이지 상에 고정 된 마우스를 유지하고 에피 조명용 변성 및 CCD (전하 결합 소자) 비디오 카메라에 접속 형광 현미경으로 움직인다. 대퇴 동맥 카테터를 탈구하지 않도록 특별한주의를 기울입니다. </li><li> 침수 목표를 사용하여 실험을 실시하고 있습니다. </li><li> cremaster의 미세 혈관의 충분한 시각화 및 세포 주입하기 전에 목표를 조정 한 후, 확률 적으로 회사의 줄기 세포 부착 이후 분석을 위해 여섯 후 모세관 세정맥을 정의합니다. </li><li> 형광 표지 된 줄기 세포를 관리,대퇴 동맥 카테터를 이용하여 다섯 경기를 연속으로 주사의 총과 1 ML의 주사기와 주입 당 0.4 × 10 6 세포에 200 ㎕의 PBS에 용해. 에 앞서 첫 번째 주사로 세포 샘플을 흔들어. </li><li> 기록 줄기 세포함으로써 일반적인 세​​포와 함께 내피 안감을 따라 셀 속도의 50 % 이상 감소로 &quot;만들기&quot;를 정의, 세포 주입 후 즉시 롤링 &quot;스틱 및 해제&quot;운동을. 롤링 줄기 세포의 카운팅과 매 사출 다음 관찰 한 분 동안 미리 정의 세정맥 거리를 통과하는 모든 줄기 세포를 수행한다. 줄기 세포 말기의 양은 모두 전달 세포의 백분율로서 표현된다. 롤링 세포로 무작위 간단한 테 더링 현상을 보이는 세포를 계산하지 않습니다. </li><li> 마지막 셀 사출 카운트함으로써 단단히 부착 줄기 세포의 수를 결정하고 번째의 계산 내피 표면 관계로 양을 표현 다음전자 사전 정의 된 6 개의 작은 정맥 (직경 x 길이 x π) 부착 세포 / mm 2로. 어떤 세포의 움직임이 30 초 동안 감지 할 수 없을 때 회사 접착 간주됩니다. </li><li> 의 intravital 현미경을 완료 한 후 신중하게 cremaster 근육을 제거하고 나중에 분석 (면역 조직 화학이나 분자 생물학)에 대응하여 저장합니다. 자궁 전위에 의해 동물을 희생. 줄기 세포 압연 회사 내피 부착뿐만 아니라, 적혈구 속도 (mm / 초), 선박 길이 (μm의), 혈관 직경 (μm의), 벽의 공유 속도와 같은 미세 혈관 혈류 역학의 정량의 intravital 현미경 기록의 분석 (초 -1), 이미지 처리 소프트웨어를 이용하여 각 실험 조직 치료 멀게 조사자에 의해 오프라인으로 수행되어야한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger.">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li><li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+stem+cells+find+their+way+home?.">How do stem cells find their way home?.</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells.">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum.">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li><li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo.">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874 (2011).</li><li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha/CXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit++bone+marrow+stem+cells.">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB-1+induces+c-kit++cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells.">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe?+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy.">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li><li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133(+)+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation.">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li></ol>

이 원고를 실시 모든 동물 실험은 지역 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

<html> 의 intravital 형광 현미경 직접 시각화 및 줄기 세포 내피 세포 상호 작용의 정량 분석​​을 할 수 있습니다. 노광 및 미세 수술 기술의 intravital 시각화가 잘 백혈구 - 내피 세포 상호 작용 및 다양한 화학 성분에 대한 연구 중에 선택적 superfusion 간단한 기술에 의해 표적 조직에 적용 할 수있는 확립 된 이후 cremaster 근육 모델은 특히 유용하다. 인해 움직임 아티팩트 심한 화상 노이즈의 부재로,?...

본 문서의 목적은 주변의 골수 줄기 세포 이동의 직접 관찰 및 분석을위한 마우스 cremaster의 미세 혈관에 적용의 intravital 현미경의 기술 (IVM)를 설명하는 것입니다. 줄기 세포의 현재 개념 기반의 조직 및 장기 재생은 손상된 조직 1 골수 유래 줄기 세포의 원점을 포함한다. 성공적인 줄기 세포의 이동을위한 중요한 단계는 내피 마이그레이션 결국 장기 생착 2 다음에 부상 기관 내에서 지방의 내피 세포와 세포의 상호 작용을 줄기가 포함되어 있습니다. 이러한 줄기 세포의 intravital 분석 - 내피 세포 상호 작용은 생체 내에서 서로 다른 병태 생리 학적 설정에서 줄기 세포 기반 재생 반응의 정량화를위한 ​​이상적인 매개 변수를 형성한다. 게다가 생각할 보인다, 미래에 특정 줄기 세포 (P)의 이동성 용량의 intravital 분석표준화 된 미세 순환 환경 내 opulations는 이전에 추가 임상 시험에이 인구를 전진 적용 할 수 있습니다. 의 intravital 현미경 초기 염증 연구 3의 분야에서 생체 내에서 백혈구 - 내피 세포 상호 작용의 관찰 및 정량화를 위해 개발되었다. 의 intravital 현미경 연구의 첫 번째 성공 기록은 광학 현미경 4에서 개구리 &#39;방언과 mesenteries을 공부하고, 19 세기에 이미 Cohnheim에 의해보고되었다. 처음 사용 IVM은 엄청난 기술 개발과 오늘을받은 이후 특정 필수 구성 요소는 양적 IVM을 수행하기 위해 전제 조건을 형성 : (I) 조직 광 액세스를 허용 준비, (ⅱ) 현미경으로 검출 할 수있다 분자 프로브, (ⅲ ) 검출 시스템 및 화상 데이터로부터 그 파라미터를 추출 할 수있다 (iv) 컴퓨터 기반 분석 시스템에 연결된 현미경4를 설정합니다. 조직 준비의 다양한 mesenteries 및 마우스와 쥐 5, 마우스, 6, 햄스터, 토끼 귀 및 이름에 햄스터 뺨 주머니의 등쪽 피하 지방 챔버의 간을 포함 IVM의 연구에 도입되었습니다. 그러나, 준비 및 시각화가 잘 표준화 된 수술로 가능으로 다음에 우리의 intravital 관찰을위한 이상적인 조직을 나타내는 마우스 cremaster 근육에 초점을 맞출 것이다, 그리고 일반적으로 운동의 유물 아무런 문제가 발생하지 않습니다. 오픈 cremaster 근육 준비는 바에즈에 의해 1970 년대에 처음 실시와 동료 7되었다. 원래 쥐에 대해 기재된, 그것은 마우스 (8)에 성공적으로 채택되었다. 이전의 연구는 주로 혈관 벽 백혈구의 상호 작용에 초점을 맞추고 난 후에, 우리 자신의 그룹은 최근에를 증명하는 등의 마우스 cremaster 근육 준비를 도입직접 시각화 및 정의 미세 구 내에서 줄기 세포 - 내피 세포 상호 작용의 정량적 분석을위한 상상력 도구입니다. 각종 줄기 세포 모집단은 뮤린 C-KIT + 골수 줄기 세포 및 중간 엽 줄기 세포뿐만 아니라 인간의 CD (133) + 골수 줄기 세포 10-12 등이 모델을 이용하여 연구되었다. 기증자의 골수 및 시각화를위한 형광 표지로부터 세포 격리 다음, 줄기 세포를 선택적으로함으로써 원격 장기 내의 세포 포획을 회피 대퇴 동맥을 통해 동맥 주입을 이용하는 cremaster 미세 혈관에 적용된다. 잠재적으로 각각 설정 내의 로컬 줄기 세포의 이동을 매개 각종 케모카인이 국소 superfusion 간단한 기술에 의해 표적 조직에 적용 할 수 있기 때문에 한층 cremaster 근육 모델은 특히 유용하다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C1157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G (1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td>83697</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin (Ketanest)</td>
			<td>Pfizer, Berlin, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylacin (Rompun)</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate - buffered saline (PBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of the microcirculation in the mouse cremaster muscle for the analysis of peripheral stem cell migration

회생 세포 치료의 맥락에서 혈관 세포 애플리케이션 프로토콜의 시대에서, 조직 nonmarrow 줄기 세포 이동의 기본 메커니즘은 완전히 명확하지 않았다. 우리는 여기에서 생체 내에서 주변의 골수 줄기 세포 이동의 분석을 위해 마우스 cremaster의 미세 혈관에 적용의 intravital 현미경의 기술을 설명합니다. M.의 cremaster의 현미경의 intravital 이전 혈관 내피 세포와 백혈구 작용의 직접적인 관찰에 염증 연구 분야에 도입되었다. 충분한 주변 줄기 및 전구 세포의 이동은 내피와 intravasculary 관리 줄기 세포의 상호 작용의 관찰과 정량 M.의 cremaster 모델을 적용하기 위해 생각할 수있다 안감 내피에 따라 확고한 접착 롤링 유사한 초기 단계를 포함하기 때문에. 각종 화학 성분을 선택적으로 표적 t에 적용될 수있는 바와 같이superfusion 간단한 기술에 의해 문제는 그것이 골수 변두리 살아있는 유기체에서 일어나는 초기 줄기 세포 모집위한 필수적인 전제 조건의 미세 환경을 확립하는 것이 가능하다.

일반적으로, 직접적으로 상호 작용이 cremaster 근육 미세 혈관 내에서 혈관 내피 세포와 줄기 또는 전구 세포를 주입하는 것은 드문 경우이며, 후 모세관 세정맥 (직경 : 30 ~ 80 μm의)에 독점적으로 발생합니다. 때문에 형광 라벨 압연에 단단히 부착 줄기 세포는 명확하게 (그림 2) 관찰 세정맥에서 내생 백혈구 순환에서 분리 정량화 할 수있다. 혈액 유속 및 벽 전단 ...

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Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

마우스 M.의 cremaster 미소 순환의 intravital 현미경은 독특하고 주변 골수 줄기 세포 이동의 분석을위한 생체 모델에서 잘 표준화을 제공합니다.

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

intravital-microscopy-microcirculation-mouse-cremaster-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K 조회수.  University Rostock.  마우스 M.의 cremaster 미소 순환의 intravital 현미경은 독특하고 주변 골수 줄기 세포 이동의 분석을위한 생체 모델에서 잘 표준화을 제공합니다. 

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The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

엑기스의 Intravital 이미징을위한 마우스 Cremaster 근육 준비

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

연구

생물학

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

엑기스의 Intravital 형광 이미징을위한 Microiontophoresis 및 미세 조작

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

쥐 Cremaster 근육의 세동맥의 셀이없는 계층의 시각화 및 정량화

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

3D-FRAP 현미경을 이용한 miRNA의 gap junction 의존적 전달 분석

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland(유선의 생체 내 세포내 현미경)

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland(유선의 생체 내 세포내 현미경)

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

제브라피쉬의 뇌를 침범하는 교모세포종 세포의 미세소관 역학의 라이브 이미징

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...