이 비디오의 목적은 조작 된 섬유 아세포 성장 인자 하나에 의해 자극 된 가속화 된 치유와 함께 Descemet의 Stripping Only의 인간 각막 장기 배양 모델을 설명하는 것입니다. Fuch의 내피 각막 이영양증 (Fecd 's Endothelial Corneal Dystrophy) 또는 FECD는 각막 내피 세포에서 펌프 기능이 손실되고 Descemet의 막 표면에 콜라겐 및 기타 세포 외 매트릭스 단백질이 과도하게 축적되어 각막 구태를 형성하는 것을 특징으로하는 질병입니다. FECD에 대한 유일하게 알려진 치료법은 다양한 형태의 내피 각막 성형술이며, 이들 모두는 거부 및 내피 세포 손실의 위험이 있습니다.
안과 수술의 발전으로 인해 이러한 절차가 시간이 지남에 따라 덜 침습적 일 수 있었지만 모든 형태의 이식에는 거부의 위험과 평생 스테로이드 사용의 가능성이 있습니다. Descemet's Stripping Only, 또는 DSO는 각막의 중앙에 국한된 굿태를 가진 FECD 환자들이 이식편 교체 없이 제거된 데세멧 막의 중앙 네 밀리미터 원을 갖는 실험적 대안이다. guttae의 제거는 건강한 말초 세포가 안쪽으로 이동하고 내피 단층을 개혁하여 결국 기질 부종을 역전시키고 시력을 개선하도록 장려합니다.
이 방법에는 많은 장점이 있지만 치유 과정은 길고 일관성이 없으며 일부 환자는 수술 다음 달에 치유가 보이지 않으면 구조 이식이 필요합니다. DSO에 이어 더 빠른 상처 치유를 자극하는 치료법은 FECD를 가진 환자에게 시술을 더 실현 가능한 옵션으로 만들 수 있습니다. 이 프로토콜은 DSO에 따른 상처 치유를 개선하기 위한 치료법을 테스트하는 것을 목표로 인간 기증자 각막을 사용하여 장기 배양 형식으로 임상 DSO 절차를 모델링하여 DSO를 FECD 환자에게 보다 실현 가능한 옵션으로 만듭니다.
우리 연구실은이 모델을 사용하여 조작 된 섬유 아세포 성장 인자로 치료 된 각막의 상처 치유를 테스트하며,이 비디오 뒷부분에서 대표적인 결과를 보여줄 것입니다. 절차의이 부분에서는 생검 펀치를 사용하여 Descemet의 막이 벗겨 질 네 밀리미터의 상처 영역을 표시합니다. 멸균 포셉을 사용하여 배지에서 각막을 제거하고 1X PBS로 헹구어 잔류 배지 및 세포 파편을 제거한다.
헹굼 후, 각막 내피 쪽을 페트리 접시의 뚜껑에 올려 놓습니다. 새로운 네 밀리미터 생검 펀치를 트리판 블루에 용접 접시에 담그고 과잉을 두드리십시오. 양손으로 펀치를 각막의 중심 위에 놓고 내피 표면에 똑바로 내려 최소한의 압력을 가합니다.
각막의 위치나 압력을 변경하지 않고 펀치를 한 손으로 옮기고 새로 자유로운 손으로 포셉에 닿습니다. 포셉을 사용하여 각막을 제자리에 고정시키고 생검 펀치를 약 90도 앞뒤로 부드럽게 여러 번 비틀어줍니다. 생검 펀치를 각막에서 똑바로 들어 올리고 따로 보관하십시오.
1X PBS로 한번 더 헹구어 과량의 트리판 블루를 제거하였다. 페트리 접시 뚜껑의 각막을 해부 범위로 옮깁니다. 구부러진 포셉으로 각막을 제자리에 고정하면 생검 펀치가 남긴 트리판 블루의 링을 따라 날카로운 30 게이지 바늘의 끝을 가볍게 드래그하여 Descemet의 막을 채점합니다.
기본 스트로마를 방해하지 않도록 최소한의 압력을 사용하십시오. 신스키 후크를 사용하면 부드러운 스쿠핑 동작을 사용하여 상처 가장자리 주변의 Descemet의 멤브레인을 들어 올리고 벗겨냅니다. 병변의 중심을 향해 일합니다.
Descemet의 막은 거의 저항하지 않아야합니다. 어려움을 겪고 있다면 스트로마를 끌어 올릴 가능성이 큽니다. 이런 일이 발생하면 상처 가장자리를 따라 새 지점에서 들어 올리면서 다시 시작하십시오.
Descemet의 막의 대부분이 스트로마에서 분리되면 Gorovoy 포셉을 사용하여 멤브레인을 제거하고 따로 두십시오. 벗겨진 부위에 남아있는 멤브레인 조각이 있는지 검사하고 Gorovoy 포셉으로 제거하십시오. Descemet의 벗겨진 후 각막을 트리판 블루로 얼룩지게하여 상처 부위를 시각화합니다.
각막을 0.01% 염화칼슘 및 염화마그네슘을 함유하는 1X PBS로 헹구어 트리판 블루와 상호작용할 수 있는 세포 파편을 제거하고 손상되지 않은 데세멧의 막에 대한 나머지 CECs의 긴밀한 부착을 촉진한다. 각막을 용접 접시에 넣고 30 마이크로 리터의 트리판 블루를 피펫에 넣고 30 초 동안 내피 층에 놓습니다. 포셉을 사용하여 각막을 부드럽게 흔들어 내피 표면 전체가 덮여 있는지 확인하십시오.
칼슘과 마그네슘으로 PDS에서 과량의 트리판 블루를 헹구고, 염색된 각막을 하루 영점 동안 해부 현미경으로 이미지화한다. 이 절차가 완료된 후, 각막을 다음의 열거된 성분들로 구성된 저혈청 배지를 함유하는 여섯 웰 플레이트에서 배양한다. 왼쪽 각막을 저혈청 배지 단독의 여덟 밀에서 배양하고, 우측 각막을 조작된 FGF-1 또는 다른 바람직한 시험 치료법으로 보충된 저혈청 배지에서 배양한다.
매일 미디어 변화로 14 일 동안 6 % CO2로 섭씨 37도에서 각막을 배양하십시오. 트리판 염색 과정을 일, 셋, 여섯, 아홉, 12 및 14일에 반복하고, 염색 직후 각 각막을 이미지화한다. 모든 시간대에서 카메라 설정을 일관되게 유지해야 합니다.
배양 기간 이후에 추가적인 얼룩은 연구 관심사, 특히 실험에 기초하여 각막에 대해 수행될 수 있다. 우리 실험실의 연구 관심사와 관련된 추가 염색에는 Alizarin 염색뿐만 아니라 EDU 혼입 및 ZO-1 단단한 접합 단백질에 대한 형광 염색이 포함됩니다. Alizarin 염색은 트립판 염색 결과를 확인하고 치유 된 부위의 세포 형태를 시각화하기 위해 세포 경계를 시각화하기 위해 수행됩니다.
ZO-1 면역형광 염색은 치유된 부위 안팎에서 특히 관심이 있는 CEC 사이의 타이트한 접합 형성의 가시화를 가능하게 한다. EdU 표지는 증식이 치유에 기여한다는 것을 확인하기위한 질적 척도로 수행되며 일부 상황에서 증식하는 세포를 정량화하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이러한 특정 염색 절차를 수행하는 방법에 대한 자세한 지침은이 비디오에 해당하는 기사에 포함되어 있습니다.
다음은 14일의 기간에 걸쳐 조작된 FGF-1의 유무에 관계없이 인큐베이션된 Eye-Bank에 의해 영양 이상성으로 판단된 한 쌍의 각막의 대표적인 이미지이다. 이미지에서 볼 수 있듯이, 조작된 FGF-1 처리된 각막은 처리되지 않은 대조군 각막에 비해 치유가 가속화되었음을 입증했습니다. 배양 기간의 말기에 추가적인 Alizarin 염색은, 세포 경계를 묘사하고 이들 발견으로 확인하는데 기여하였다.
이 관찰은 임상 DSO 절차와 가장 관련이있는 각막의 샘플에서 모델을 검증하기 위해 영양 장애 각막의 11 쌍에 걸쳐 복제되었습니다. ImageJ와 같은 이미지 처리 소프트웨어는 여기에서 볼 수 있듯이 상처 치유 진행을 정량화하기 위해 이러한 이미지에서 염색 된 영역을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 조작된 FGF-1로 처리된 모든 영양 장애 각막은 14일째에 더 큰 치유를 보였으며, 처리되지 않은 짝에 비해 대조군 각막에서 38%와 대조적으로 평균 91%의 치유를 초래하였다.
그리고이 차이는 통계적으로 유의했습니다. 공초점 영상에 의해 가시화된 추가적인 면역조직화학은 이전의 Alizarin 염색 패턴을 반영하여 ZO-1 타이트한 접합 단백질의 반조직화된 발현을 밝혀냈다. EDU 표지는 상처 부위 내 및 주변에서 증식하는 세포의 존재를 확인하였고, 처리되지 않은 대조군에 비해 처리된 각막에서 더 높은 수준으로 보였다.
일부 각막쌍에서, CEC 사멸은 상처 부위, 특히 영양 장애 각막에서 보이는 주변부일 수 있다. 다음은 실질적인 말초 세포 사멸을 나타내는 트리판 염색된 각막의 예시적인 이미지이다. 이미지에서 볼 수 있듯이, 말초 세포 사멸은 주로 초기 시점에서 발생하고 배양 기간에 걸쳐 점차적으로 역전된다.
이러한 말초 염색은 상처 부위 가장자리의 위치를 확인하는 것이 어려울 수 있으므로 상처에 연결할 때 상처 부위의 정량을 복잡하게 만들 수 있습니다. 그러나, 모든 경우에, 말초 트리판 염색은 최종 14일 시점에서 측정 가능한 이미지를 생성하기에 충분히 제거되었다. 우리는이 현상이 전 생체 내에서 배양 된 각막 기증자에게 독특하며 생체 내에서 인간의 각막과 관련이 없다고 생각합니다.
말초 내피의 손상은 DSO의 임상 사례 연구에서보고되지 않았기 때문에 우리의 지식에. 원거리 주변 염색으로 지칭되는 두 번째 염색 패턴이 Alizarin Red 이미지에서 포착되었지만, 배양 기간 전반에 걸쳐 트리판 블루 이미지에서도 명백하였다. 이 관찰은 손상된 내피를 나타내는 사지 주위의 어두운 염색의 고리를 특징으로합니다.
이 용어에도 불구하고,이 패턴은 정상 및 영양 장애 각막 모두에서 매우 흔했기 때문에 말초 염색에 대해 양성으로 계산되지 않았습니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 Descemet의 스트리핑 후 조작 된 FGF-1로 처리 된 배양 각막에서 향상된 치유 결과를 입증 할 수있었습니다. 또한,이 스트리핑 프로토콜은 DSO를 연구하는 다른 연구자들에게 유용한 방법으로 사용되며 다른 상처 치유 요법 테스트, 수술 기술에 대한 수정 평가, 다양한 기증자 집단 또는 질병 단계에서 치유 비교를 포함한 다양한 응용 분야에 활용 될 수 있습니다.
우리는이 연구 및이 프로토콜을 사용하는 다른 연구가 임상의가 미래에 자격을 갖춘 FECD 환자에게 가치있는 치료 옵션으로 DSO를 고려하도록 장려하기를 바랍니다.
