이 프로토콜은 단일 분석 플레이트에서 단백질 과 1 차 항체 농도를 모두 최적화하고 단일 샘플 준비를 사용하여 두 개의 분석방법을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 데이터 분석을 포함한 2 1/2 일의 실험실 작업을 3 1/2 시간 안에 완료 할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 ALS에 대한 혈액 기반 바이오 마커를 개발하기위한 높은 처리량 분석 형식을 제공하고 큰 임상 시험을 수행하기위한 이상적인 방법입니다.
이 방법은 질병 예후 도중 표적 단백질 단면도에 통찰력을 제공할 수 있고 흥미로운 임상 시험의 약의 효력의 감시를 용이하게 할 수 있습니다. ALS 환자와 건강한 피험자로부터 100마이크로리터의 인간 혈소판 용액을 수집한 후 모세관 레이아웃 및 샘플 준비를 위해 사내에서 생성된 템플릿을 작성하십시오. 샘플 혼합물 준비 테이블은 동적이며 소스에서 제거해야 하는 볼륨을 자동으로 계산합니다.
모든 분석 시약을 얼음 위에 놓습니다. 실온에 남아 있어야 하는 표준 팩을 제외 하 고 있습니다. 형광 마스터 믹스를 준비하려면 DTT의 투명 튜브에 40 마이크로리터의 탈온화 물을 추가하고 10X 샘플 버퍼20 마이크로리터를 추가합니다.
그리고 제조 된 400 밀리머 DTT 용액의 20 마이크로 리터는 분석 키트에서 핑크 튜브에. 바이오티니티드 래더를 준비하려면 16마이크로리터의 탈이온화된 물, 10X 샘플 버퍼의 마이크로리터 2개, 준비된 400밀리플러 DTT 용액 2개를 키트에 제공된 화이트 튜브에 추가합니다. 부드러운 혼합 후, 디스터링하기 전에 200 마이크로 리터 PCR 튜브로 사다리 용액을 전송합니다.
10X 샘플 버퍼 1.5 마이크로리터와 148.5 마이크로리터의 디온화된 물을 600 마이크로리터 마이크로센티어 튜브와 소용돌이에 넣고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 테이블에 표시된 대로 직접 희석제를 관심 있는 항체를 추가하고 균질성 항체 용액에서 파이펫 팁을 여러 번 플러시한다. 모세관 샘플 믹스를 준비하려면 모든 PCR 튜브를 열고 역피팅 기술을 사용하여 테이블에 표시된 대로 각 튜브에 형광 5X 샘플 버퍼1.6 마이크로리터 알리쿼트를 추가합니다.
버퍼가 추가되면 각 튜브를 즉시 닫습니다. 모든 버퍼가 추가되면 모든 튜브를 열고 테이블에 표시된 대로 볼륨에 0.1X 샘플 버퍼를 추가하고 버퍼가 추가될 때 각 튜브를 즉시 닫습니다. 다음으로, 모든 튜브를 열고 테이블에 표시된 대로 단백질 샘플을 추가하고 각 튜브 캡을 즉시 닫습니다.
모든 샘플이 추가되면 벤치 탑 원심 분리기의 모든 튜브를 간략하게 원심분리합니다. 소용돌이가 샘플을 다시 혼합하고 원심분리합니다. 두 번째 원심 분리가 끝나면 모든 튜브를 가열된 뚜껑이 있는 열순환기에 넣습니다.
그리고 표시된 조건하에서 샘플을 분해합니다. 데니션의 끝에서 원심분리기, 샘플을 다시 혼합및 원심분리하고 모든 튜브를 얼음 위에 튜브 랙에 놓습니다. 그림을 가이드로 사용하여, 잘 D1에 스트렙타비딘 고추냉이 과로시다제 10 마이크로 리터를 추가, D5를 통해 D2를 웰하는 적절한 이차 항체의 10 마이크로리터, 각 행 B에 희석된 항체 의 10 마이크로리터, C25를 통해 C2를 웰에 적절한 1차 항체의 마이크로리터 10개, PCR 튜브 번호 1에서 A1까지 바이오틴래터 5개 , A25를 통해 A2행 시료 3개, 갓 준비된 루미놀 과산화소15마이크로리터를 각 웰에 E.Pipetting 시료 믹스와 시약을 올바른 순서로 작은 우물로 하는 것은 실험의 성공에 매우 중요하므로 매우 신중하게 수행해야 한다.
그런 다음 지정된 각 세척 버퍼에 500 마이크로리터의 세척 버퍼를 잘 추가합니다. 그리고 원심분리에 의해 플레이트 내용물 아래로 회전. 분석 플레이트에서 모세관 분석을 수행하려면 모세관 분석기를 온라인 시스템에 연결하고 계측기를 클릭하고 분석기 소프트웨어에 연결합니다.
팝업 메뉴 내에서 계측기 일련 번호를 선택하고 연결을 클릭합니다. 분석 탭을 선택하고 새 분석기를 선택하고 분석 매개 변수를 입력하고 파일 이름과 위치를 저장합니다. 그런 다음 분석기의 깜박이는 파란색 표시등이 단단한 파란색임을 확인하고 포장에서 모세관 카트리지를 제거합니다.
분석 플레이트에서 보호 씰을 제거하고 기포에 대한 미리 채워진 우물을 시각적으로 관찰합니다. 분석판을 플레이트 홀더에 놓고 모세관 카트리지를 비스듬히 잡고 카트리지를 모세관 슬롯에 삽입하고 분석기 문을 닫습니다. 그런 다음 분석기 소프트웨어에서 시작을 클릭합니다.
분석에서 전체 혈소판 용해 혼합물을 사용하면 표적 단백질의 신호 강도를 감소시키고 높은 배경 신호에 기여할 수 있다. 따라서, 이 분석에서, 명확한 상체는 혈소판을 파열 한 후 사용되었다. 혈소판 시토솔 단백질 농도에 대한 선형 다이나믹 레인지는 밀리리터당 0.2~0.8밀리그램으로 확립되었고, 단백질 농도와 1차 항체 적정이 단일 분석에서 모두 수행될 수 있도록 에세이 템플릿을 채택했다.
높은 다이나믹 레인지 검출 프로파일은 모세관 분석의 감도가 높기 때문에 훨씬 더 넓은 동적 범위를 제공하므로 더 큰 샘플 농도 범위에 비해 더 나은 검출 및 정량화를 초래합니다. 개별 노출 시간도 정의할 수 있습니다. 최적화된 분석 조건을 사용하여, 이 분석은 2개의 항체세트를 사용하여 ALS 환자에게서 얻은 세포질 분획을 분석하여 샘플 내의 질병 별 TDP-43 및 인광 유도체의 식별을 허용합니다.
그런 다음 총 TDP-43은 교정 곡선을 사용하여 정량화될 수 있습니다. 그리고 인트라 및 인터-런 분석 변이성은 풀이 된 인간 ALS 혈소판 세포질 분획에서 테스트되었다. 이 방법은 1 차적인 항체의 사용을 허용하고, 단일 분석 실행에서 동일한 샘플 내에서 최대 5개의 상이한 표적 단백질의 식별을 용이하게 한다.
이 기술은 단백질 분석 시간을 실질적으로 줄일 뿐만 아니라 마이크로리터 샘플 볼륨이 필요하며 높은 수준의 재현성을 통해 결과를 생성합니다. 이 분석기와 모든 인간 샘플에 사용되는 화학 물질 중 일부는 생체 위험으로 간주되므로 이러한 실험을 수행 할 때 적절한 개인 보호 장비를 항상 사용해야합니다.
