이 프로토콜은 내장과 갑상선이 바이러스 확산을 방해하는지 여부를 결정할 수 있으며 이집트숲모기에 의해 전염되는 모기 매개 바이러스의 위험 평가에 도움이 될 수 있습니다. 우리의 프로토콜에는 아르보 바이러스의 벡터 능력을 효과적으로 평가할 수 있는 경구 수유와 흉강내 주사의 두 가지 감염 방법이 포함되었습니다. 이 프로토콜은 뎅기열 바이러스 및 Aedes의 지카 바이러스 감염과 같은 다양한 모기 매개체의 추가 아르보 바이러스 감염에 적용될 수 있으며 실행 가능한 절차로 판명될 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 연구 조교 인 Fei Wang이 될 것입니다. 인공 모기 먹이 시스템을 사용하여 인공 먹이를 수행하려면 콜라겐 막을 적절한 크기로 자르고 O-링으로 저장소에 고정합니다. 3 밀리리터의 바이러스 - 혈액 혼합물을 저장소에 넣고 누출을 방지하기 위해 플라스틱 플러그를 사용하여 저장소를 밀봉하십시오.
모기가 들어있는 플라스틱 컵을 글러브 박스에 넣으십시오. 밀봉된 저장소를 FU1 공급 장치에 나사로 고정하고 하나의 저장소에 하나의 컵을 넣습니다. 전원 장치를 켜고 모기에게 1 시간 동안 먹이를주십시오.
먹이를 먹은 후 모기가 희미 할 때까지 몇 초 동안 얼음으로 마취하십시오. 마취 된 모기를 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 붓고 뚜껑을 빨리 덮으십시오. 집게로 충혈 된 암컷 모기를 골라 컵당 50 마리의 암컷 모기로 새 플라스틱 컵에 옮깁니다.
컵을 자른 모기장 메쉬로 감싸고 중간에 구멍이있는 뚜껑으로 덮으십시오. 스폰지를 작은 조각으로 자르고 컵에 올려 놓으십시오. 플라스틱 일회용 스포이드를 사용하여 스폰지에 8% 포도당 용액을 추가합니다.
암컷 모기가 들어있는 컵을 섭씨 27도, 습도 80 %의 인큐베이터에 10 일 동안 놓습니다. 72시간마다 새 포도당 포화 스폰지를 교체하십시오. 흉부 내 접종의 경우, 텍스트 원고에 설명 된대로 암컷 모기를 준비하십시오.
감염성 바이러스 희석액을 준비하려면 섭씨 80도 냉동고에서 바이러스 스톡을 꺼내 얼음에서 해동합니다. 100 내지 500 플라크 형성 단위 바이러스를 함유하는 100 나노리터 바이러스 희석액으로 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지로 바이러스 스톡을 희석한다. 바이러스 희석액을 얼음에 놓습니다.
다음으로, 열 지수를 450으로, g에서 110까지의 힘, 밀리미터 단위의 거리를 1로, 초 단위에서 0으로 설정된 바늘 풀러 프로그램의 매개 변수로 Puller 1000을 사용하여 미세 주입 바늘을 준비합니다. 핀셋으로 뽑은 바늘 끝을 16배 배율로 해부 현미경으로 자릅니다. 일회용 멸균 주사기를 통해 바늘에 미네랄 오일을 다시 채웁니다.
기계의 지침에 따라 바늘을 인젝터에 부착합니다. 감염성 바이러스 희석액이 들어있는 튜브에 바늘을 조심스럽게 삽입하십시오. 그런 다음 채우기 버튼을 눌러 약 4마이크로리터의 바이러스 희석액을 바늘에 채웁니다.
바늘이 채워지면 바늘을 만지거나 손상시키지 마십시오. 핀셋으로 약 50 마리의 암컷 마취 모기를 골라 얼음 접시에 올려 놓습니다. 인젝터 아래에 플레이트를 놓고 해부 현미경으로 모기의 흉강에 바늘을 삽입합니다.
주입량을 100 나노리터로 설정하고 속도를 초당 50 나노리터로 설정합니다. 주입 버튼을 눌러 바이러스 용액이 모기로 흐르도록 합니다. 성공적으로 주사하면 복부가 약간 부풀어 오릅니다.
감염된 모기를 얼음 위에 놓인 새 플라스틱 컵에 넣으십시오. 감염된 모기의 수가 충분하면 컵을 모기장 메쉬로 감싸고 뚜껑으로 덮으십시오. 감염된 암컷 모기에서 타액을 채취하려면 마취 된 모기를 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 붓고 뚜껑을 빨리 닫으십시오.
침지 오일로 채워진 10마이크로리터 피펫 팁을 고무 진흙 위에 나란히 놓습니다. 핀셋으로 암컷 모기를 골라 얼음 접시에 올려 놓습니다. 핀셋으로 다리와 날개를 제거하십시오.
각 피펫 팁에 모기 한 마리의 입 부분을 놓아 실온에서 모기에 의해 기름으로 분비되는 타액을 수집합니다. 45 내지 60분 후, 200 마이크로리터의 바이러스 희석제 배지가 들어 있는 1.5-밀리리터 튜브에 피펫 팁을 넣는다. 튜브를 섭씨 4도에서 5 분 동안 5, 000g에서 원심 분리하여 타액을 튜브로 배출합니다.
이후 투과율을 측정하기 위해 타액 함유 튜브를 섭씨 80도에 보관하십시오. 타액 채취 후 감염된 암컷 모기를 해부합니다. 핀셋을 사용하여 모기의 머리를 자르고 각 머리를 200마이크로리터의 RPMI 1640 배지가 들어 있는 개별 튜브에 넣습니다.
핀셋으로 흉부를 잡으십시오. 그런 다음 다른 핀셋으로 복부의 끝에서 두 번째 부분을 잡고 내장을 빼냅니다. 흩어진 조직과 장기가 있는지 장을 청소하십시오.
PBS로 장을 세척하고 각 장을 200마이크로리터의 RPMI 1640 배지가 들어 있는 개별 튜브에 넣습니다. 바이러스 전파 및 감염률의 후속 측정을 위해 이 튜브를 섭씨 80도에 보관하십시오. 이 대표적인 분석에서는 감염 후 10일 동안 암컷 모기의 장, 머리 및 타액에 있는 바이러스 RNA를 측정했습니다.
흉강내 접종된 모기의 내장, 머리 및 타액에 있는 Ebinur Lake 바이러스의 바이러스 역가는 경구 감염 모기보다 높았습니다. 흉강내 접종 모기의 감염 및 파종률은 각각 100%, 경구에 감염된 모기의 감염률은 70%와 38.1%로 나타났다. 흉부 내 접종 모기의 전염률은 최대 90 %에 달했지만 구강에 감염된 모기의 경우 4.8 %에 불과했다 먹이가 바이러스 함량에 영향을 미치기 때문에 일관성을 유지하기 위해 충혈 된 암컷 모기를 골랐다.
