이 프로토콜은 세포에 Wolbachia의 존재를 확인하는 데 도움이되며, 이는 Wolbachia와 그 숙주 간의 상호 작용을 이해하는 기초입니다. 이 프로토콜에서는 세포 내 울바키아 감염을 성공적으로 탐지하기 위해 네 가지 방법이 사용되었으며, 이는 세포의 울바키아 감염의 검출 정확도를 확증하고 개선했습니다. 절차를 시연하는 것은 Qiuqiu Xiao, 현대 병원체 생물학 및 특성의 핵심 실험실에서 대학원이 될 것입니다.
염색되지 않은 Aa23 및 Aa23-T 세포를 광 현미경을 사용하여 100x 배율로 관찰함으로써 시작하십시오. 세포를 플라스크 당 70 내지 80% 합류율에 도달하도록 5 내지 7일 동안 배양한다. 피펫을 사용하여, 배양액 1 mL를 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.
세포를 수확하기 위해 5분 동안 100 RCF에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고 생성된 세포 펠릿을 영하 20도에서 저장한다. 세포를 플라스크 당 90 내지 100% 합류율에 도달하기 위해 5 내지 7일 동안 배양한다.
펠렛을 0.40 mL의 PBS에 재현탁시키고, 이 용액 50 마이크로리터를 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 20 mg/mL 프로테이나제 K 5 마이크로리터를 첨가하고 섭씨 55도에서 한 시간 동안 배양한다. 그런 다음 튜브를 섭씨 99도에서 15분 동안 배양하여 조질 DNA를 얻고 영하 20도에 보관한다.
PCR을 수행하기 위해, 20 마이크로리터의 총 반응 혼합물을 제조하고, 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 PCR 조건을 설정한다. 겔 이미저를 사용하여 1% 아가로스 겔에서 DNA를 검출한다. 실시간 PCR 시스템에서 TB Green을 사용하여 정량적 PCR 증폭을 수행하고 각 반응의 결과를 기록한다.
20 마이크로리터의 총 반응 부피에서 DNA를 분석하고, 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 정량적 PCR 조건을 설정한다. 확립된 표준 곡선에 따라 세포에서 WSP 및 RPS6 유전자 카피 수를 계산한다. 그런 다음 wsp/RPS6의 복사본 수로 Wolbachia 상대 밀도를 계산합니다.
독립적인 샘플 t-검정을 사용하여 데이터를 분석합니다. 세포 펠릿에 200 마이크로리터의 용해 완충액을 첨가하고 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다. 용해물을 섭씨 4도에서 12, 000 RCF에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인한다.
제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 상청액의 wsp 농도를 분석하십시오. 15%SDS-PAGE 젤에 동일한 양의 단백질을 로딩합니다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고 실온에서 두 시간 동안 5% 탈지유로 막을 막는다.
그런 다음 TBST로 멤브레인을 세 번 씻으십시오. 멤브레인을 섭씨 4도에서 1차 항체를 5% 탈지유로 희석하여 제조한 100마이크로리터의 항-wsp 폴리클로날 항체로 밤새 인큐베이션한다. 일차 항체를 TBST로 세 번 세척한다.
100 마이크로리터의 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 이차 항체를 멤브레인에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕기에서 배양한다. 멤브레인을 TBST로 세 번 세척하고 화학 발광 검출 키트에 20 마이크로리터의 용액 A와 20 마이크로리터의 용액 B를 일대일의 비율로 혼합한다. 전체 멤브레인을 발광 용액에 동시에 담그고 다기능 이미징 시스템을 사용하여 신호를 관찰하십시오.
레이저 공초점 페트리 접시에서 Aa23 및 Aa23-T 세포를 섭씨 28도에서 5% 대기 이산화탄소 하에서 사흘에서 나흘 동안 배양한다. 세포가 60 내지 70%합류에 도달하면, PBS로 세포를 세 번 세척한다. 세포를 섭씨 4도에서 20분 동안 4%파라포름알데히드 한 mL에 고정시킨다.
고정된 세포를 PBST를 이용하여 다섯 분 동안 세척하고 PBS로 세포를 두 번 재세척한다. 페트리 접시를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 3%소 혈청 알부민 한 mL에 배양한다. 100 마이크로리터의 마우스 항-wsp 폴리클로날 항체 및 마우스 혈청을 슬라이드에 첨가하고, 이를 섭씨 네 도의 습윤 박스에서 밤새 인큐베이션한다.
젖은 상자에서 페트리 접시를 꺼내 실온으로 되돌립니다. PBS로 세 번 세척하고 PBS를 제거하였다. 다음 절차를 빛으로부터 보호하십시오.
페트리 접시를 100 마이크로리터의 알렉사 플루오르 488-접합된 염소 항-마우스 항체와 함께 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 샘플 페트리 접시를 PBS에 희석된 DAPI 50 마이크로리터와 함께 섭씨 37도에서 10 마이크로그램/mL로 5분 동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척한다. 공초점 현미경으로 면역 염색을 관찰하십시오.
울바키아를 검출하기 전에, Aa23 및 Aa23-T 세포를 두 세포주 사이의 형태학적 차이를 결정하기 위해 광학 현미경으로 관찰하였다. Aa23 및 AA23-T 세포는 적어도 두 개의 세포 형태를 가졌으나 두 세포 유형 간에 명백한 형태학적 차이는 관찰되지 않았다. 진단 프라이머 81F/691R을 사용하여, 울바키아 wsp 유전자의 양성 증폭은 Aa23 세포에서 검출되었지만 Aa23-T 세포에서는 검출되지 않았다.
세포주에서 울바키아 밀도를 분석한 결과, Aa23 세포에서는 wsp/rps6 비율이 2.4였지만 Aa23-T 세포에서는 울바키아가 나타나지 않았다. 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 Aa23에 대해 강한 wsp 신호를 나타내었지만 Aa23-T에 대한 신호는 검출되지 않았다. 간접 면역 형광 분석은 Aa23 세포에서 wsp 단백질을 검출한 반면, DAPI 염색된 DNA만이 Aa23-T 세포에서 검출되었다.
배양 플라스크가 5 내지 7일 동안 5% 대기 이산화탄소 하에서 섭씨 28도에서 배양되도록 보장한다. 이 절차는 샘플 준비 및 단면화에 특별한주의를 기울여야하는 전자 현미경 검사로 이어질 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 네 가지 실험 방법은 세포에서 Wolbachia 감염의 검출 정확도를 확인했으며, 이는 다른 유형의 세포 및 조직에도 적용 할 수 있습니다.
