Name: laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody at JoVE.com

The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;.

주 : 적절한 포유 동물 발현 벡터는이 프로토콜을 사용해야합니다. 여기서, 두 발현 카세트를 포함하는 하나의 구조가 사용되는 (즉, 중쇄 및 경쇄 발현 별도 프로모터에 의해 구동된다). 트라 스투 주맵 중쇄 및 경쇄 이전 벡터에 클로닝 하였다. 이 벡터는 비영리 플라스미드 저장소 (13)를 통해 얻은 앤드류 Beavil의 선물이었다. 1. 복구 및 벡터 DNA의 스케일 업 참고 : 벡터 DNA가 대장균 XL-1 블루 균주에 부드러운 한천 자상 문화로받은; 벡터는 하이 그로 마이신 내성을 전달한다. <ol><li> 다음 질주 루리아 베르 타니 (LB) 한천 플레이트는 75 μg의로 제조 된 자상 문화의 부드러운 한천로 멸균 접종 자상 또는 루프를 삽입 / 격리 식민지에 대한 하이 그로 마이신 ㎖로. 18 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 75 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신을 함유하는 5 ㎖의 좋아요 국물 (TB)로 단일 식민지의 예방. 인큐225 rpm으로 떨고에 18 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 BATE 문화. </li><li> 부드럽게 -80 ° C에서 cryovial 및 동결에 200 ㎕의 80 % 글리세롤과 문화의 800 μl를 혼합하여 벡터 DNA의 글리세롤 주식을 준비하기 위해 야간 문화를 사용합니다. <ol><li> 포함 된 100 ml의 TB에 하룻밤 문화의 100 μl를 추가 75 μg의가 / 당황 진탕 플라스크 (즉, 1 / 1,000 희석)에서 하이 그로 마이신 ㎖로. 225 rpm으로 진탕으로 18 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 문화를 품어. </li></ol></li><li> 하룻밤 배양 한 후, 추출하여 다음과 같은 예외와 미디 / 맥시 준비 키트의 제조 업체의 지시에 따라 DNA를 정화; 물 (PH 7.0-8.5)와 마지막 단계, 용출 또는에 resuspend DNA 동안. </li><li> 다음 -20 ° C에서 DNA를 저장 260, 280 nm의 농도와 흡광도 측정에 의한 DNA의 순도를 확인합니다. 참고 : 선택 사항 (추천) : 시퀀스 DNA 신원을 확인하기 위해 벡터 특이 프라이머를 사용하여. </li></ol> 이. HEK-293 세포의 안정적인 형질 <ol><li> 성장 삼각 플라스크에 0.1 % 비이 온성 계면 활성제로 보충 된 무 혈청 배지에서 표준 프로토콜에 따른 HEK-293 세포 (세포 현탁액)을 유지한다. 2 × 105 세포 / ml 및 계대마다 넷째 날에 유지한다. 5 % CO 2, 120 rpm으로 회전 37 ° C에서 배양 세포. 참고 : 세포는 더 적은 4 일 이상 배양하고 및 형질 전환없이 4 주 이상 전에해야합니다. 혈청 - 함유 배지에서 단층으로 성장 된 HEK-293 세포는이 절차에 사용될 수있다. </li><li> 날에 형질 감염 전에, 씨드 HEK-293 세포로 12 웰 플레이트의 웰에서 3 × 105 세포 / ml의 2 내지 10 %의 열 - 불 활성화 소 태아 혈청이 보충 된 둘 베코 변형 이글 매체 (DMEM)의 ㎖ ( FBS). 형질의 날, 세포 80-90%의 포화 상태에 도달했는지 확인 </li><li> 다음 함께 혼합 형질 미디어에서 별도로 DNA와 폴리에틸렌 이민 (PEI)를 희석.<ol><li> 300 ㎕를 형질 미디어에 잘 당 1.25 μg의 벡터 DNA (12 우물 15 μg의)를 희석. 실온에서 5 분간 인큐베이션. </li><li> (12 우물 30 μL, 즉 1 : PEI에 DNA의 2 비율) 1 ㎎ / ㎖ PEI 솔루션의 2.5 μl를 희석하여 300 ㎕를 형질 미디어를. 실온에서 5 분간 인큐베이션. </li><li> 부드럽게 섞어 실온에서 15 분 동안 품어 희석 PEI에 희석 DNA를 추가합니다. </li></ol></li><li> 플레이트의 각 웰에 DNA / PEI 혼합 적가의 50 μl를 추가합니다. 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 형질 전환 혼합물을 다음 플레이트를 배치 분배 부드럽게 플레이트 락. </li><li> 물론 당 B를 하이 그로 마이신과 10 일 동안 37 ° C, 5 % CO 2 판을 반환 ㎖ / 50 μg의 추가. 참고 : 안정적으로 형질 세포가 가능한 플레이트에 부착 될 것입니다 반면 10 일째으로 취소 형질 세포, 판의 표면 사망과 분리 된 것입니다. </li><li> 와 우물에서 미디어를 교체1/4 볼륨 혈청이없는 미디어 및 3/4 볼륨 DMEM 10 % FBS (즉, 0.5 ㎖의 혈청이없는 미디어 + 1.5 ml의 DMEM = 7.5 % 최종 혈청 농도)과 4 일 동안 배양으로 보충. </li><li> 10 % FBS (+ 1 ml의 DMEM = 5 % 최종 혈청 농도 즉, 1 ㎖의 혈청이없는 미디어)로 보충 1/2 볼륨 혈청이없는 미디어 및 1/2 볼륨 DMEM으로 우물에서 미디어를 교체하고 4 일 동안 배양한다. </li><li> 10 % FBS (즉, 1.5 ml의 무 혈청 미디어 + 0.5 ml의 DMEM = 2.5 % 최종 혈청 농도)로 보충 3/4 볼륨 혈청이없는 미디어 및 1/4 볼륨 DMEM으로 우물에서 미디어를 교체하고 4 일 동안 배양한다. </li><li> 0.1 % 비 이온 계면 활성제 (즉, 0 % 최종 혈청 농도)로 보충 혈청이없는 미디어의 2 ml의 우물에서 미디어를 교체하고 4 일 동안 배양한다. 참고 : 무 혈청 적응하는 동안 세포에 50 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신 B 선택적 압력을 유지한다. 혈청이없는 매체에 적응 세포는 우물의 표면에서 분리하고 난 클러스터 수있다n 개의 서스펜션. 50 μg의의 추가 보충와 배양 조건에 대한 2.1 단계를 참조하십시오 / B를 하이 그로 마이신 ㎖로 </li><li> 피펫을 사용하여 부드럽게 별도의 튜브로 12 웰 플레이트와 풀 세포에서 서스펜션 문화를 섞는다. <ol><li> 혈구를 사용하여 2 × 105 세포 / ml에서의 삼각 플라스크에 30 mL의 무 혈청 배지에서 세포를 모으고 종자 열거. 5 % CO 2, 120 rpm으로 회전 37 ° C에서 배양 세포. 하위 문화와 모든 넷째 날 확장합니다. </li></ol></li><li> / 1 × 10 7 세포에 10 병을 얻기 위해 필요한 세포 밀도에 문화의 크기를 확장 액체 질소에 냉동 보존을위한 유리 병 계속합니다. 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 함유하는 무 혈청 배지에서 세포를 동결. 주 : 항체를 함유 된 배지는 단백질 생산을 확인하는 각 계대에서 수확 또는 정제 조건을 최적화하는데 이용 될 수있다. 에어컨 미디어를 수확하고 계대 배양을위한 세포 유지에 문화를 원심 분리하려면5 분 동안 300 XG은 0.22 μm의 필터로 상청액을 필터 소독. 상등액을 여과 1-2 주 이상 장기 보관 -20 ° C 4 ℃에서 유지 될 수있다. </li></ol> 배치 자라다 문화 3. 대규모 항체 생산 참고 : 항체 생산은 기존의 세포가 설치되도록 배치 자라다 문화 부피를 기준으로 필요한 세포 밀도로 확장하는 단계 2.11에서에 따라 할 수있다. 그렇지 않으면, 냉동 보존에서 해동 된 세포는 한 번 적절한 세포 밀도 및 볼륨 확장이 단계에서 시작합니다. 다양한 배양 보조제는 항체 생산을 최적화하기 위해 사용될 수있다; 트립 톤의 사용은 항체 수율이 프로토콜에 설명된다 증가합니다. <ol><li> 종자 세포 개의 삼각 플라스크에 100 ㎖의 무 혈청 배지에서 2 × 105 세포 / ml로 (보충-UN 영양 보충 된 배양 물로부터 항체 생산량을 비교). 37 문화 ° C, 5 % CO 2 </sUB&gt; 120 rpm으로. </li><li> 24 시간 후, 영양 보충 문화에 0.5 %의 최종 농도 트립 톤을 추가합니다. 혈청이없는 미디어 않은 보충 문화의 볼륨을 균등하게. </li><li> 하루 8에서, 세포 생존을 모니터링하는 혈구를 사용하여 매일 문화의 세포 수를 수행합니다. 세포 생존율은 80 % 이하가되면, 배양 상청액을 수확. <ol><li> 3,000 XG에 15 분에서 문화의 원심 분리하여 수확 뜨는은 0.22 μm의 필터를 통해 뜨는 (포함하는 항체)를 필터 - 소독. 4 ° C (단기)에서 상층 액을 저장 또는 -20 ° C (장기)에 동결. </li></ol></li></ol> 친 화성 크로마토 그래피 4. 항체 정제 자동화 된 고속 단백질 액체 크로마토 그래피를 사용하여 (FPLC) 시스템 참고 : 다음 절차는 일반적으로 대부분의 자동화 된 시스템에 적용될 수있다. 정제는 상온에서 또는 4 ° C에서 (FPLC 시스템 시원한 방에서 보관되어있는 경우) 될 수있다.정찰 일련의 테스트 (결과 섹션 참조) 조정 배지로부터 정제 된 항체의 최대 복구를 보장하는 버퍼, 용출 버퍼의 pH를 결합 적절한 열 매트릭스를 포함하는 최적의 정제 조건을 식별하기 위해 수행 될 수있다. 최적의 조건은 항체 또는 단백질 정제 된에 따라 달라집니다. 이 정제를 자동 FPLC 체계에서 수행되었다. 정제를 5 ㎖는 단백질의 열을 사용하여 실온에서 수행 하였다. <ol><li> 초순수를 이용하여하기 완충액을 제조 한 후, 0.22 μm의 필터로 필터링 추천 pH로 조정한다. <ol><li> 0.14 M 염화나트륨, 0.0027 M의 KCl, 0.01 M 나 2 HPO 4, 0.001 M KH 2 PO 4 : 다음을 혼합하여 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 pH 7.4 (결합 완충액) 1 L를 준비합니다. 버퍼를 필터링하기 전에 필요한 경우 산도를 조정합니다. </li><li> 0.1 M 글리신 - 염산 pH가 2.7 (용출 버퍼) 500 ml의를 준비합니다. 버프를 필터링하기 전에 산도를 조정어. </li><li> 1 M 트리스 산도 9.0 (중화 버퍼) 50 ㎖를 준비합니다. </li></ol></li><li> 만들어진 컴퓨터와 모든 시스템 전원 및 통신 연결을 확인합니다. 장치 소프트웨어 &#39;시스템 관리&#39;모듈에 표시해야한다. 확인 UV 셀은 280 nm 파장으로 설정된다. 선택 사항 : 연결되어 사용되는 경우 pH 측정기를 보정합니다. </li><li> 시스템을 씻어 초순수에 A, B 및 샘플 펌프의 입구 관 빠져. 튜브의 공기 시스템의 공기의 의심이있는 경우 주사기 펌프 퍼지. 시스템 제어기를 통해 또는 자동화 된 방법을 통해 수동 조작에 의해 물 시스템을 씻는다. 그 압력, 전도성, UV280 추적 및 pH가 일관성을 유지하고 열에 대한 압력 한계가 제조업체의 사양에 따라 초과하지 않도록 관찰한다. 참고 : 이상이 진행하기 전에 해결해야 시스템에 공기 또는 차단을 나타낼 수 있습니다. </li><li> 시스템 제어기 모듈에서, 하나의 유량을 시작할ml / 분 수동 중 부하의 펌프 A를 통해 (샘플 루프를 우회) 또는 열을 연결하는 시작 위치 (샘플 루프를 통해) 주입. 시스템을 분리 컬럼 위치 입구 배관 및 칼럼 입구에 연결 마개를 제거한다. <ol><li> 물은 그 칼럼 시스템 튜브를 부착 기둥의 상부에 시스템 튜빙 적하로부터 흐르게. 열 유입을 갖는 입구 피팅 물 방울 넘쳐하면 기포가없는 연결을 보장합니다. </li></ol></li><li> 하류 출구에 열 배출구를 부착하고 모든 피팅이 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. 열이 현재 시스템에 연결을 통해 열 사양에 설명 된대로, 최대 압력 제한 및 유량에 대한 제한을 초과하지 않습니다. </li><li> 물 5 컬럼 부피 (CV)와 열을 씻으십시오. 필요한 경우 UV280 추적이 안정 될 때까지 열 세척을 계속합니다. </li><li> 버퍼 바인딩에서의 입구 튜브를 담가, 용출에 B는 버퍼와 바인딩 버퍼 t의 샘플 펌프올바른 출력 버퍼에서 시스템을 평형. 수동 조작에 의해 PumpWash를 사용하여 버퍼 입구 튜브를 입력합니다. </li><li> 소프트웨어의 &#39;입력기&#39;모듈 설치에있어서 마법사를 사용하도록되어 열에 대한 친 화성 크로마토 그래피 방법을 사용한다. 참고 : 자동 FPLC 시스템은 방법 권장 설정 (즉, 유량 및 압력 제한)이 자동으로 입력 및 정제를 위해 선택한 열 (제조업체, 매트릭스 및 크기)에 따라 단계를 실행 제공됩니다. <ol><li> 단백질 친 화성 크로마토 그래피에 대해 다음 실행 단계를 사용하여 <ol><li> 바인딩 버퍼 5 CV와 시스템을 평형 및 폐기물 용기에 유체 통과를 수집합니다. </li><li> 컬럼 상에로드 샘플과 별도의 용기에 유체 통과를 수집 (볼륨이 방법에서 수동으로 지정로드 할). </li><li> 바인딩 버퍼 5 CV 및 씻을 시스템은 별도의 용기에 유체 통과를 수집합니다. </li><li> 5 CV의 isocrat와 용출 열용출은 버퍼 및 분수 수집기에 의해 분수로 정제 된 항체 샘플을 수집하여 IC의 분류. </li><li> 바인딩 버퍼 5 CV와 시스템을 평형 및 폐기물 용기에 유체 통과를 수집합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 메소드가 설치되면, 조정 배지의 부피는 컬럼에 적용되도록 지정 및 저장 방법. 참고 :이 방법에 지정된 볼륨이 샘플을 실행하는 동안 공기의 도입을 피하기 위해 실제 용량보다 5 ~ 10 ml의 작아야합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 특정 부피는 90-120 ml 인 것을. </li><li> 조절 된 미디어가 들어있는 용기에 샘플 펌프 호스 잠수함. </li><li> 지정된 출구 배관을 통해 샘플 유체 통과를 수집하기 위해 별도의 용기를 준비합니다. 주 : 열 또는 정제 R에 다시 적용 할 수있는 유체 통과를 요구 초과 오류가 실행하거나 열 결합능 동안 발생하는 경우의 유체 통과를 수집하는 것이 중요epeated. </li><li> 분수 집에서 수집 튜브를 준비합니다. 1 ml의 비율 적당 중화 버퍼의 100 μl를 추가합니다. FPLC 시스템을 자동으로 수집 튜브에 분획을 용출한다. </li><li> 소프트웨어의 &#39;제어 시스템&#39;모듈, 상기 방법을 실행하는 열한다. 주 :이 방법은 실행에있어서, 분획 수집기 설치의 변수를 확인하고 그 결과 파일명과 저장 위치를 ​​정의하는 것을 포함하는 일련의 페이지에 개시된다. </li><li> 실행을 시작하려면 시작을 클릭하십시오. 실행은 &#39;시스템 관리&#39;모듈에서 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 정제 실행의 완료시, 시스템 소프트웨어에서의 평가 &quot;모듈에서 얻어진 크로마토 그램을 확인한다. </li><li> 별도의 튜브로 버퍼 교환 모두 단백질 - 함유 분획을 결합 및 차단 30 kDa의 분자량 원심 필터 장치를 이용하여 PBS로 농축시켰다. 제조업체에 따라 원심 분리 단계를 수행명령. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 bicinchoninic 산 분석 (BCA)을 사용하여 항체 농도를 측정한다. </li><li> 다른 정화 실행이 수행 될 경우, 바인딩 버퍼와 반복의 주요 샘플 펌프 호스는 4.9-4.14 단계를 반복합니다. </li><li> 정화 실행 완료시, 초순수에서 A, B 및 샘플 펌프의 입구 튜브를 체험하고 3 단계에서 수행 할 때 시스템과 열을 씻는다. </li><li> 시스템 및 열 저장을 위해 20 %의 에탄올과 반복 세척 과정에서 A, B 및 샘플 펌프 호스 잠수함. </li><li> 하류 콘센트에서 열을 분리하고 열 마개를 교체 한 후 입구에서 열을 분리하고 마개를 교체, 시스템에 튜브를 다시 연결합니다. 4 ° C에서 열을 저장합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Nelson, A. L., Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+trends+for+therapeutic+antibody+fragments.">Development trends for therapeutic antibody fragments.</a> Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).</li><li>Drake, P. M., Rabuka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+playbook+for+antibody-drug+conjugates:+lessons+from+the+laboratory+and+clinic+suggest+a+strategy+for+improving+efficacy+and+safety.">An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety.</a> Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).</li><li>Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+antibodies.">Bispecific antibodies.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).</li><li>Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+challenges+for+the+next+generation+of+therapeutic+antibodies.">Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies.</a> Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Food and Drug Administration. 22, (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> European Medicines Agency. 13, (2014).</li><li>Lopez-Morales, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+and+biological+characterization+of+a+biosimilar+trastuzumab.">Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab.</a> Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).</li><li>Jung, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+Remsima.">Physicochemical characterization of Remsima.</a> MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).</li><li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+and+functional+comparability+between+the+proposed+biosimilar+rituximab+GP2013+and+originator+rituximab.">Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab.</a> BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+different+vector+designs+for+the+mammalian+expression+of+recombinant+IgG+antibodies.">A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies.</a> J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).</li><li>Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+IRES+elements+in+mRNAs+to+the+eukaryotic+translation+apparatus.">Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus.</a> Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).</li><li>Ho, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+Tricistronic+vectors+for+enhancing+generation+of+high+monoclonal+antibody+expressing+CHO+cell+lines.">IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines.</a> J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).</li><li>Dodev, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tool+kit+for+rapid+cloning+and+expression+of+recombinant+antibodies.">A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies.</a> Sci Rep. 4, 5885 (2014).</li><li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+protein+biopharmaceuticals.">Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals.</a> Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).</li><li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+vector+design+and+multi-pathway+modulation+of+HEK+293E+cells+yield+recombinant+antibody+titers+exceeding+1+g/l+by+transient+transfection+under+serum-free+conditions.">Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).</li><li>Bebbington, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+of+a+recombinant+antibody+from+myeloma+cells+using+a+glutamine+synthetase+gene+as+an+amplifiable+selectable+marker.">High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker.</a> Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).</li><li>Kaufman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coamplification+and+coexpression+of+human+tissue-type+plasminogen+activator+and+murine+dihydrofolate+reductase+sequences+in+Chinese+hamster+ovary+cells.">Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells.</a> Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).</li><li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines.">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transient+transfection+of+serum-free+suspension-growing+HEK293+EBNA1+cells:+peptone+additives+improve+cell+growth+and+transfection+efficiency.">Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).</li><li>Yang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+valproic+acid+to+CHO+cell+fed-batch+cultures+improves+monoclonal+antibody+titers.">Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers.</a> Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).</li><li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproic+acid:+a+viable+alternative+to+sodium+butyrate+for+enhancing+protein+expression+in+mammalian+cell+cultures.">Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures.</a> Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).</li><li>Jiang, Z., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+butyrate+stimulates+monoclonal+antibody+over-expression+in+CHO+cells+by+improving+gene+accessibility.">Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).</li><li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate.">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 프로토콜은 HEK-293 세포에 형질 감염 안정 발현 및 치료 용 항체의 정제 사항. 항체 유전자의 안정한 발현은 치료 용 항체의 개발 및 제조에 대한 항체 생산 세포주를 생성하는 첫 번째 단계이다. 중국어 햄스터 난소 (CHO) 세포 치료 용 단백질에 대한 선택의 발현 플랫폼 남아 있지만, HEK-293 세포주 게시물의 측면에서 이들 세포에서 생성 된 단백질이 자연적으로 인간 단백질을 발생하는 가까운 ?...

치료 용 항체의 성공은 차세대 치료제의 물결이 시작으로 항체 개발에 상당한 투자를 구동하기 위해 계속된다. 항체 시장은 유리한 속성 4 항체 단편 1 항체 - 약물 접합체 (2) 특이 적 항체 (3)과 조작 항체로 재 성형 될 것으로 예상된다. 제약 관심을 얻고 또 다른 클래스는 바이오시 밀러입니다. 바이오시 밀러 항체는 이미 규제 당국의 승인을받은 치료 항체의 제품을 복제 &#39;매우 유사한&#39;이다. 제안 된 바이오시 밀러는 구조, 기능, 동물 독성, 임상 적 안전성과 유효성, 인간의 약동학 (PK), 약력학 (PD) 및 면역 원성 5, 6에 대한 송신자 항체와 비교해야합니다. 승인 연구바이오시 밀러 항체의 ATES 인해 제품의 최종 품질에 엄격한 제약으로 느린왔다. 이러한 최종 처리 단계에 이르기 세포주 및 배양 조건과 정확히 특정 제조 공정 독자적인 남아있을 수있다. 무엇보다, 항체의 제조는 본질적으로 매우 유사한 제품을 생산하는 도전에 추가 할 수있는 변화의 정도를 포함한다. 포괄적 물리 및 생물 리 학적 특성화 및 비교는 매우 곤란하고, 또 밀러 항체의 특성을 입증하는 연구들이 문헌 7, 8, 9에 나타나고있다. 치료 항체를 생성하는 것은 각각의 항체 유전자를 운반하는 벡터를 포유 동물 숙주 세포의 형질 감염과 함께 시작된다. 벡터 디자인, 세포주 및 배양 조건은 예를 설정하기위한 주요 고려 사항은Pression의 시스템입니다. 항체의 DNA 서열은 약 은행 (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) 또는 특허 공보를 포함한 연구에서 공급 될 수있다. 예를 들어, 트라 스투 주맙의 순서는 약물 은행 (: DB00072 DB의 ID)를 통해 사용할 수 있습니다. 가변 영역의 아미노산 서열은 바람직한 숙주 종에서 합성 유전자의 디자인 및 최적화를 겪을 수있다. 그것은 더 변형되는 아미노산 서열로 이루어지지 않은 밀러 항체 중요하다. 합성 후, 항체 유전자는 선택의 적절한 벡터 내로 클로닝 할 수있다. 인간 IgG 항체는 두 개의 동일한 중쇄 2 개의 동일한 경쇄로 구성되어 있습니다. 두 체인의 단단히 규제 발현은 포유류 세포 (10)의 이종의 IgG 단백질의 최적 생산을 위해 필수적이다. 사슬 간 이황화 결합을 형성 할 수 있고 번역 후 변형의 개수에 있어야 할뿐만 아니라 인트라단백질 생합성 동안 scaling과 shearing. 벡터의 수는 항체 유전자 (재료의 표 참조) 표현하기 위해 특별히 설계되었습니다이 가능합니다. 이 항체 고유 벡터는 일반적으로 각 체인 그렇게 만 가변 영역 복제를 필요로 무거운 가벼운 모두 체인의 일정 영역을 표현한다. 두 개의 독립적 인 구조 (공동 트랜)와 세포의 형질 감염은 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 전달하기위한 가장 일반적인 방법이다. 즉, 각각의 유전자가 소포체에 조립되기 전에 자신의 프로모터에 의해 구동되는 분리 된 항체 사슬로 전사된다. 한편, 멀티 cistronic 벡터는 mRNA를 (11)의 내부 영역에서 허용 번역 된 단일의 mRNA 전 사체 여러 유전자의 발현을 허용 혼입 내부 리보솜 진입 사이트 (IRES) 요소를 가지고있다. 이 경우, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자는 ARRANG로 연결된다두 항체 쇄 (10) (12)의 공동 발현을 달성 장담. 일시적으로 형질 감염된 세포는 실험 제한을 수행하기에 충분한 단백질을 수득하지만, 게놈 통합을위한 선택을받은 안정적으로 형질 감염된 세포주는 높은 수율을 제공 할 수있다. 높은 단백질 량은 시험 관내 특성화 관련 분석법 개발을 허용하며 클론 세포주 리드 후보 선택으로 하류 애플리케이션을 고려하여 항체의 품질의 표시를 제공 할 수있다. 이 문서의 목적은 포유 동물 발현 시스템에서 생산 된 치료 용 항체의 안정적인 발현과 정제를 설명한다. 실제로,이 방법은 밀러 항체의 발현에 적용될 수있다. 이 방법은 시간이 많이 소요 인트이라도 임계로 진행하기 전에 항체의 초기 특성에 사용될 수있다대규모 생산을위한 바람직한 클론을 식별 PS. 또한,이 방법은 다른 단백질뿐 아니라 항체를 발현하는데 사용될 수있다. 상세한 프로토콜은 치료 용 항체 트라 스투 주맵의 발현을 설명한다. 이 자동화 된 크로마토 그래피 방법에 의해 HEK-293 세포주 및 항체 단백질의 정제 안정한 형질 뒤에 벡터 DNA의 준비로 구성된다.

<table><tbody><tr><td>pFUSE vector series</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.</td></tr><tr><td>mAbXpress vector series</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>pVITRO1 vector</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.&amp;nbsp; Refer to: Dodev, T. S. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr><td>GS vector series</td><td>Lonza</td><td></td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&amp;kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&amp;kappa; was a gift from Andrew Beavil.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro Agar</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>Used to prepare low salt LB agar containing 75 &amp;micro;g/ml hygromycin.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>Used to prepare low salt TB broth containing 75 &amp;micro;g/ml hygromycin.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol, BioXtra, &amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000&amp;nbsp;</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td>Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at -80 &amp;deg;C until use.</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Life Technologies</td><td>12309-050</td><td>Transfection formulated serum-free media</td></tr><tr><td>Hygromycin B Solution</td><td>Jomar Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone (casein peptone)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at 4 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.</td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid, monohydrate</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl solution pH 9.0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>Used to buffer exchange and concentrate purified protein.</td></tr><tr><td>Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>fort&amp;eacute;BIO</td><td>45-5000</td><td>Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.</td></tr><tr><td>Protein A biosensors</td><td>fort&amp;eacute;BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution</td><td>Astral Scientific</td><td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate (APS)</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Astral Scientific</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Dual-Color Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr></tbody></table>

laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

도 1에 제시된 바와 같이 형질 감염된 HEK-293 세포에 의해 트라 스투 주맙의 안정적인 생산이 바이오 - 층 간섭 (BLI)을 이용하여 확인 하였다. IgG의 표준 곡선은 IgG 항체 표준 단백질 바이오 센서 (도 1a) 사이의 결합 비율을 측정하여 생성 하였다. 조 상등액 시료를 유사하게 측정 한 후, 그 농도는 표준 곡선 (도 1b)에서 보간. 상등액의 농...

Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody at JoVE.com

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

이 프로토콜은 포유 동물 발현 시스템에서의 치료 용 항체의 생산을 설명한다. 설명하는 방법은 친 화성 크로마토 그래피를 사용하여 대규모 문화와 정화의 설정 벡터 DNA, 안정적인 형질 전환 및 인간 배아 신장 293 세포주의 무 혈청 적응의 준비를 포함한다.

실험실 규모의 생산과 치료 용 항체의 정제

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

laboratory-scale-production-and-purification-of-a-therapeutic-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.3K 조회수.  University of Sydney.  이 프로토콜은 포유 동물 발현 시스템에서의 치료 용 항체의 생산을 설명한다. 설명하는 방법은 친 화성 크로마토 그래피를 사용하여 대규모 문화와 정화의 설정 벡터 DNA, 안정적인 형질 전환 및 인간 배아 신장 293 세포주의 무 혈청 적응의 준비를 포함한다. 

비디오: Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

연구

의학

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

검출 실험 프로토콜<em&gt; 시아 노 박테리아</em&gt; 항체 마이크로 어레이 칩과 액체 및 고체 시료에

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

환경과학

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

암 연구학

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

생체공학

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포의 단일 클론 항체의 정화 및 분석

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

항체 생성: 융합 세포를 사용한 단일 클론 항체 생성

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

교육

JoVE Science Education

심화생물학

면역학

Production and Purification of Recombinant Antibodies from Mammalian Cells

Source: Shivange, Gururaj, et al. <a href="https://app.jove.com/v/60727">Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen-Specific Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp.(2020).
The video explains the process of producing antibodies in mammalian host cells, from gene expression to secretion. It involves transcription, translation, signal recognition, correct folding, and eventual release into the extracellular medium via secretory vesicles.

포유류 세포에서 재조합 항체의 생산 및 정제

1. Expression and purification of antibodies

	Maintenance of CHO cells
	
		Grow CHO cells in FreeStyle CHO Media supplemented with commercially available ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Production and Purification

A Technique to Purify Monoclonal Antibodies Produced by Chinese Hamster Ovary Cells

Source: Velugula-Yellela, S. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58947">Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay for purifying monoclonal antibodies from cell culture fluid harvested from Chinese Hamster Ovarian cells. It employs a porous glass resin with immobilized protein A, which binds to the Fc region of the antibodies in the sample, effectively separating them from contaminants. The use of a low-pH elution buffer weakens the interaction, facilitating the retrieval of purified antibodies.

중국 햄스터 난소 세포에서 생산된 단일클론 항체를 정제하는 기술

1. Purification of antibody
NOTE: The equilibration buffer for the in-house antibody is 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. The elution buffer used is 0.1 M ...

Antibody Production from a Batch Overgrowth Culture of Transfected Mammalian Cells

Source: Elgundi, Z. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017)
The video demonstrates a method for producing therapeutic antibodies using stably transfected mammalian cells. Tryptone supplementation stimulates cell division, resulting in overgrowth and supporting a higher antibody yield. The antibody-containing medium is harvested, filtered, and stored for further use.

형질주입된 포유류 세포의 배치 과성장 배양에서 항체 생산

NOTE: A suitable mammalian expression vector must be used for this protocol. Here, a single construct containing two expression cassettes is used ...

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

Source: Elgundi, Z., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of antibody-containing fractions.

단클론 항체 정제를 위한 친화성 크로마토그래피 기법

1. Antibody Purification by Affinity Chromatography Using an Automated Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System
NOTE: The following procedure can ...