심혈관 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인입니다. 마우스 모델은이 질병을 연구하기위한 유용한 도구이며, 우리의 프로토콜은 마우스에서 동맥 경화증을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 병변 크기를 세 가지 혈관 위치에서 측정할 수 있습니다.
대동맥 뿌리, 대동맥 아치, 브라치오세팔릭 동맥. 마우스에서 죽상 동맥 경화증의 정량화는 지루한 작업일 수 있습니다. 우리는 프로세스속도를 높일 수 있기를 바랍니다 상세한 단계를 제공했습니다.
이러한 단계 중 일부는 서면으로 설명하기가 어렵습니다. 이 비디오가 강력한 죽상 경화성 병변 크기 분석을 얻는 데 도움이되기를 바랍니다. 표준 프로토콜에 따라 마우스 심장을 수확한 후, 코르크 침대에 심장을 놓고, 복부 쪽을 해부 현미경 아래에 놓고 바늘을 사용하여 정점을 통해 코르크에 심장을 고정시하십시오.
해부학 적 집게로 심장의 기초를 잡고, 처진 평면에서 20도 각도로 유지 메스를 사용, 및 트랜스 버사 체평면에 20도, 심장의 정포 2/3을 잘라. 대동맥 뿌리와 심장의 베이스를 최적의 절삭 온도 화합물 또는 OCT에 포함하고, 부드럽게 대동맥 뿌리를 채우고 기포를 제거하기 위해 집게로 심장을 짜냅니다. 표본을 100월로 채워진 극저온의 바닥으로 옮기고, 바닥면에 수직으로 대동맥 뿌리가 있고, 건조한 얼음에 화합물을 동결한다.
그런 다음 티슈 샘플을 냉동고 가방에 영하 80도의 냉동고 백에 보관하여 저온분면까지 보관합니다. en 얼굴 분석을 위한 고정 침대를 준비하려면 파라핀 왁스 필름 세그먼트를 8번 접어 평평한 25mm 표면을 만들고 필름 주위에 검은 전기 절연 테이프를 감싸 대어 어두운 배경을 만듭니다. 고정 침대의 뒷면에 라벨을 놓고 리드 연필을 사용하여 마우스 식별 번호를 기록합니다.
대동맥 아치를 고정 침대로 옮기고 조직에 PBS 한 방울을 추가합니다. 스테레오 현미경을 사용하여, 나머지 주변 지방 조직에서 대동맥을 청소하고 부드럽게 대동맥을 조작하거나 손상시키지 않고 주변 지방 조직을 모두 벗겨 바나 스 가위와 듀몬트 집게를 사용합니다. 다음으로, 반나스 가위를 대동맥 루멘에 도입하여 동적인 표면을 노출시한다.
승천 아치의 외부 곡률을 탈방향으로 자르고, 브라치오세팔릭 동맥을 포함하여 가지를 계속 자르고 내림차순 흉부의 등쪽 부분을 아끼기 시작합니다. 친밀감 표면을 표시하려면 곡률을 적게 자르고 대어를 엽니다. 마이크로 카스트로비에호 바늘 홀더를 사용하여, 시편을 스트레칭하지 않고 분 곤충 핀의 무딘 끝으로 고정 침대에 열린 아치를 고정하고, 조직이 제자리에 고정될 때 시편에서 핀을 부드럽게 구부립니다.
그런 다음 고정 된 아치 페이스다운을 PBS의 페트리 접시에 섭씨 4도에 보관하십시오. 수단 IV 염색의 경우, 아치가 아래로 향하고 70 %에탄올의 페트리 접시에 5 분 동안 표본을 헹구고, 7 분 동안 수단 IV 작업 용액의 접시에 표본을 전송합니다. 인큐베이션의 끝에서, 80%에탄올에 2개의 3분 세척으로 샘플을 헹구고, PBS에서 최종 헹구는 다음 원래 페트리 접시로 조직을 되돌려 보도록 합니다.
그런 다음 10배율로 디지털 카메라에 연결된 스테레오 현미경으로 현미경을 획득하여 PBS에 잠긴 고정 된 아치의 이미지를 얻고 작은 금속 무게를 사용하여 고정 침대를 페트리 접시의 바닥에 고정하십시오. 내장된 대동맥 뿌리의 저온절을 얻으려면 극저온 온도를 영하 20도, 단면 두께를 10 마이크로미터로 설정합니다. 심실 조직이 바깥쪽으로 향하는 시편 홀더에 대동맥 뿌리를 포함하는 OCT 블록을 마운트한다.
필요한 경우 10월을 추가하여 포지셔닝을 확보하십시오. 대동맥 뿌리는 이제 칼날에 수직으로 배치되어야 합니다. 일반 현미경 슬라이드에 심장 근육 조직을 포함하는 초기 통제 단면을 수집하고, 가벼운 현미경의 밑에 200 마이크로미터마다 조직을 통해 진행을 확인합니다.
첫 번째 대동맥 커프가 나타나면 시편을 0점 커프쪽으로 기울여 섹션 평면을 다른 두 커프스와 정렬하고 0점 부터 잘라낸 10 마이크로미터 섹션마다 계산합니다. 계획된 슬라이드에 따라 90 마이크로미터에서 이후 분석을 위한 섹션을 수집하기 시작하여 0점부터 800 마이크로미터에 도달했습니다. 대동맥 뿌리의 전체 용기 영역의 병변 분획을 계산하면 단면화 중 가능한 각도 차이에 데이터가 덜 민감해집니다.
또한, 마우스당 곡선 또는 아테로토 병변 크기 하에서 영역을 계산하고 그룹 내의 개별 변형을 더욱 시각화하기 위해 점 플롯에 데이터를 제시하는 것이 예시적일 수 있다. 레시오날 지질 축적은 전체 병변 영역의 색 임계값 오일 레드 O 양성 영역에 의해 정량화될 수 있다. 오른쪽 및 왼쪽 관상 동맥은 일반적으로 종종 가장 눈에 띄는 병변 크기와 일치하는 대동맥 부비동에서 약 250 마이크로 미터 대동맥에서 분기합니다.
en face 대동맥 아치의 대표적인 이미지에서 어두운 배경을 제거하면 시각적 디스플레이가 향상될 수 있습니다. 병변 크기는 일반적으로 그룹 내에서 분포되어 그룹 간에 학생의 t-테스트를 사용하여 통계 분석을 허용합니다. 실험 샘플을 처리하기에 충분한 기술을 습득할 때까지 일부 테스트 자료로 연습하는 것이 좋습니다.
병변 크기가 그룹 간에 다른 경우, 병변 조성 해석이 일반적으로 추구하는 다음 단계이기 때문에 메커니즘을 결정해야 합니다.
