조혈 줄기와 전구 세포의 대사 변화는 혈액 형성의 요구를 유지하기 위해 그들의 정지 상태에서 분화 상태로 전환 할 수 있습니다. 조혈 줄기와 선조 세포의 대사 가소성에 있는 변경은 혈액학 무질서로 이끌어 냅니다. 우리의 프로토콜은 혈액 발달 과 질병 도중 조혈 줄기 및 전구 세포의 신진 대사 규칙 그리고 건강을 측정하는 것을 도울 것입니다.
조혈 줄기 및 전구 세포의 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스의 분석은 연약하고 희소한 인구이기 때문에 어렵습니다. 당사의 최적화된 프로토콜은 골린 골수로부터 더 많은 양의 조혈 줄기 및 전구세포를 분리하고, 잠복 시 생존력을 향상시키고, 비부착 HSPC의 세포외 플럭스 분석을 용이하게 하며, 산화 인산화뿐만 아니라 글리코리스틱 경로를 대상으로 하는 약물에 최적화된 사출 파라미터를 제공합니다. 이 절차를 시작하려면 유틸리티 플레이트의 우물과 우물 주변의 챔버를 멸균 물로 채웁니다.
센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 잠그면 센서가 완전히 물로 덮여 있는지 확인합니다. 그런 다음 유틸리티 플레이트에 잠긴 카트리지를 섭씨 37도의 비 CO2 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서, 분석 플레이트의 각 웰에 시판 되는 0.1%PLL 솔루션의 40 마이크로 리터를 추가합니다.
키트에 제공된 뚜껑으로 분석 판을 덮고 후드 아래실온도에서 1시간 동안 닫힌 플레이트를 배양합니다. 그 후, 멸균 진공 기반 의 흡인기를 사용하여 과도한 용액을 제거하고 후드 아래 플레이트를 건조시합니다. 단핵골골골수 세포를 수확하려면 밀도 그라데이션 배지 5밀리리터를 15밀리리터 원추형 튜브에 추가합니다.
천천히 골수 세포 현탁액의 5 밀리리터를 추가하여 세포가 밀도 그라데이션 배지 위의 층으로 남아 있는지 확인합니다. 원심분리기는 500배 g, 실온에서 30분 동안 원심분리기가 가능한 가장 낮은 가속을 보장합니다. 모노뉴클레아드 세포의 중간 인터페이스를 신선한 15 밀리리터 튜브로 수확하십시오.
그런 다음 2 %의 FBS를 포함하는 1X PBS의 5 밀리리터로 세포를 씻으시다. 원심분리기는 500배, 섭씨 4도에서 5분간. 2%의 FBS를 포함하는 1X PBS의 300 마이크로리터에서 상체를 제거하고 세포를 다시 중단합니다.
다음으로, FACS 튜브에서 염색되지 않은 또는 단일 색 제어를 위한 세포 현탁액의 10 마이크로리터를 aliquot. 단핵골골골수 세포에서 LSK HSPC를 수확하려면 15마이크로리터의 비오틴 항체 칵테일을 단핵골수 세포의 300마이크로리터에 추가합니다. 단핵골골골수 세포에서 LSK HSPC를 수확하려면 15마이크로리터의 비오틴 항체 칵테일을 단핵골수 세포의 300마이크로리터에 추가합니다.
튜브를 냉장고에 셰이커에 놓은 얼음 양동이에 넣고 섭씨 4도에서 30분 동안 교반하여 배양합니다. 그런 다음 세포에 2 %의 FBS를 포함하는 미리 냉각 된 1X PBS의 10 밀리리터를 추가하십시오. 원심분리기는 500배, 섭씨 4도에서 5분간.
2%의 FBS를 함유한 1X PBS의 400마이크로리터에서 슈퍼네티티를 폐기하고 세포 펠릿을 재보힙. 사용하기 전에 안티 비오틴 마이크로비드를 간략하게 소용돌이시다. 각 샘플에 마이크로비드 80마이크로리터를 추가하고 잘 섞어보습니다.
섭씨 4도에서 20분 간 추가로 배양하여 동요합니다. 그 후, 세포에 2%의 FBS를 포함하는 미리 차가운 PBS의 10 밀리리터를 추가합니다. 원심 분리는 500 배 g와 5 분 동안 섭씨 4도에서 튜브를 원심 분리합니다.
상체를 버리고 2 %의 FBS를 포함하는 PBS의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 자기 분리 장치를 설정하는 동안 셀 서스펜션을 섭씨 4도에 보관하십시오. 자기 보조 셀 분류 분리기의 자기장에 열을 섭씨 4도에서 배치합니다.
섭씨 4도에서 중력 흐름하에서 2%의 FBS를 함유한 1X PBS 3밀리리터로 헹구어 자기 분리를 위한 컬럼을 준비한다. 셀 서스펜션을 섭씨 4도의 습식 열에 추가합니다. 모든 세포가 섭씨 4도에서 컬럼을 통과하고 15 밀리리터 원원형 튜브에서 유출물을 수집할 수 있도록 합니다.
다음으로, 1X PBS의 3밀리리터와 섭씨 4도에서 2%의 FBS로 컬럼을 세척합니다. 이 세척을 세 번 반복합니다. 흐름을 수집하고 섭씨 4도에서 유지합니다.
원심 분리는 500 배 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 흐르는 흐름을 포함하는 원심관을 분리합니다. 상체를 버리고 2 %의 FBS로 1X PBS의 0.5 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 서스펜션을 FACS 튜브로 옮기십시오. 그런 다음 LSK 항체 칵테일의 24 마이크로리터를 각 1,000만 개의 세포에 추가합니다.
호일로 튜브를 덮고 1 시간 동안 동요와 함께 섭씨 4도에서 어둠 속에서 배양하십시오. 그 후 FACS 튜브에 2%의 FBS를 갖춘 1X PBS 3밀리리터를 추가합니다. 원심분리기는 500배, 섭씨 4도에서 5분간.
상체를 폐기하고 2%의 FBS를 포함하는 1X PBS의 1밀리리터에서 항체 표지된 세포를 재중단한다. 정렬 직전에 밀리리터 프로피듐 요오드당 1밀리리터를 세포 현탁액에 넣고 40 마이크로미터 여과기를 사용하여 FACS 튜브의 내용을 필터링합니다. 첫째, 수집된 LSK 세포를 500배 g및 실온에서 5분간 원심분리합니다.
상체를 버리고 40 마이크로리터 당 적어도 70, 000 세포의 최종 농도로 전체 매체에서 세포를 재연하십시오. 이 셀 서스펜션의 40 마이크로리터를 PLL 코팅 된 8 웰 플레이트의 우물에 씨앗40 마이크로 리터는 모든 코너 우물을 비워 두십시오. 원심 분리는 450 배 g와 1 분 동안 실온에서 접시를 원심 분리합니다.
반전된 현미경을 사용하여 세포가 우물 바닥에 부착되도록 합니다. 그 후, 각 웰의 최종 부피를 175 마이크로리터에 가져오는 각 우물의 세포에 완전한 매체의 135 마이크로리터를 추가합니다. 플레이트의 두 모서리에 175마이크로리터의 완전한 미디어를 공백으로 추가합니다.
2 시간 동안 섭씨 37도에서 비 CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하십시오. 그런 다음 분석기가 표 2 및 텍스트 프로토콜의 표 3에 설명된 대로 플레이트의 각 웰에 약물을 추가하는 프로그램을 설정합니다. 미토콘드리아 응력 시험을 위해, 각 웰이 두 개의 마이크로몰라 올리고마이신, 1.5 마이크로몰라 FCCP, 그리고 필요에 따라 로테네및 항 마이신 A의 0.5 마이크로몰라의 최종 농도를 가지도록 인큐베이터로부터 유틸리티 플레이트내의 센서 카트리지를 회수한다.
센서 카트리지에서 뚜껑을 분리하여 기기 트레이에 놓습니다. 20분이 소요되는 교정 프로세스를 시작합니다. 교정이 완료되면 유틸리티 플레이트를 제거하고 LSK 셀을 포함하는 분석 플레이트로 대체하십시오.
계속 눌러 이전에 설정된 프로그램을 계속 시작합니다. 프로그램이 완료되면 데이터를 검색하고 분석합니다. 이 연구에서는, 실행 가능한 Murine LSK HSPC의 최대 양은 고립되고 그들의 glycolysis 및 미토콘드리아 물질 대사는 세포외 플럭스 분석기로 측정됩니다.
세포 외 플럭스 분석은 전통적으로 부착 세포에 사용되지만,이 방법은 LSK HSPC가 세포 외 플럭스의 측정을 허용하고 따라서 LSK HSPC의 대사 건강을 허용하는 PLL 코팅 우물에 부착하게. 기저 및 응력 조건에서 세포외 산성화 율을 통해 산소 소비율 및 글리코리시를 통해 미토콘드리아 호흡을 측정하기 위해 글리코리시스및 미토콘드리아 호흡을 방해하는 약물을 순차적으로 주입한다. 예상대로, 외세포 산성화 율의 기저 수준은 음의 미디어에서 배양된 것과 비교하여 포도당 및 피루바테 양성 배지에서 배양된 LSK HSPC에 대해 더 높다.
포도당을 가진 주사는 양성 매체에서 배양된 세포에 대한 세포 외 산성화 비율을 바꾸지 않았지만, 부정적인 매체에서 세포의 글리코리시저를 증폭시켰다. 그러나, 이 세포의 기저 수준은 여전히 양성 단에서 더 낮게 남아 있었습니다. 올리고마이신을 함유한 주사는 양수 군의 최대 수준에서 글리코분해를 활성화시켰지만 부정적인 그룹에는 영향을 미치지 않았다.
2-DG에서 포도당 아날로그를 가진 주사는 비 혈당 수준으로 세포외 산성화 비율을 반환했습니다. 미토콘드리아 스트레스 시험의 경우, 올리고마이신의 주사는 미토콘드리아 막과 극화되어 ETC 복합체를 통해 더 많은 양성자가 펌핑되는 것을 방지하여 미토콘드리아 호흡 속도를 감소시킨다. FCCP의 주사는 세포가 미토콘드리아 막 전위를 복구하려고 할 때 산소 소비 속도를 최대로 밀어 넣습니다.
다른 전자 수송 사슬 억제제 2개를 가진 주사는 미토콘드리아 호흡을 완전히 정지시키고 따라서 산소 소비 비율이 그것의 최소 수준으로 되돌아간다는 것을 일으키는 원인이 됩니다. 단핵 세포 절연을 위한 적세포 용해 버퍼의 사용을 피하십시오. 우리는 덩어리 형성을 방지하고 LSK의 손실을 줄이기 위해 Ficoll 그라데이션 분리를 권장합니다.
최적화된 방법을 사용하여 희귀하고 깨지기 쉬운 조혈 줄기 및 전구 세포의 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시를 측정하고 대사 큐의 연구는 정상 및 악성 조혈을 조절할 수 있습니다.
