이 프로토콜은 표적 단백질의 글리코-프로파일에 대한 다중 글리코실화 효소의 효과를 스크리닝하고 효소의 기능성에 대한 더 나은 이해에 기여하는데 이용될 수 있다. 프로토콜의 본질은 일시적이면서도 높은 처리량 방식으로 글리코실화 효소의 스크리닝을 허용한다. 변경된 글리코실화 프로파일은 개선된 항체 활성을 유도할 수 있고, 따라서 최종 생성물의 효능을 증가시킬 수 있다.
바이오 제약 회사는 중요한 품질 특성으로 글리코실화를 면밀히 모니터링합니다. 비정상적인 글리코실화는 암과 같은 질병의 특징입니다. 따라서이 방법은 약리학 및 생물 의학 연구와 관련이 있습니다.
이 프로토콜은 사용자가 포유동물 세포 형질감염 및 웨스턴 블로트를 포함한 여러 실험 기술에 대한 경험이 있다고 가정합니다. 더 적은 수의 샘플로 시작하고 첫 번째 인스턴스에서 중지 지점을 사용하는 것이 좋습니다. 중국 햄스터 난소 세포의 밀도와 생존력을 평가하여 시작하십시오.
그런 다음 오염을 피하기 위해 70 % 에탄올과 RNase 억제제 용액으로 생물 안전 캐비닛 및 모든 장비를 조심스럽게 청소하십시오. 다음에, 세포를 5분 동안 100배 G에서 펠릿화하고, 밀리리터당 여섯 개의 세포에 다섯 배의 세포 밀도로 미리 가온된 배지에서 10배로 재현탁시킨다. 여덟 마이크로리터의 DsiRNA 마스터 믹스 또는 대조군을 멸균 전기천공 큐벳으로 옮깁니다.
800 마이크로리터의 셀 현탁액을 동일한 큐벳에 첨가하고, 혼합하고, 전기천공 펄스를 전달한다. 그런 다음 큐벳에서 여섯 웰 플레이트의 한 웰로 셀 현탁액을 옮겨 거품과 같은 물질을 피하십시오. 세포를 진탕 없이 10분 동안 인큐베이션한다.
인큐베이션 후, 800 마이크로 리터의 미리 데운 배지를 첨가하여 웰 당 1.6 밀리리터의 최종 부피를 만드십시오. 형질감염된 세포를 150 RPM에서 진탕하면서 인큐베이터에서 성장시킨다. 48시간 후, 상청액과 세포를 수확한다.
IgG 정제 후, 용출 A를 3-킬로달톤 분자량 컷오프 원심 농축기 상에 첨가하고, 섭씨 4도에서 40 내지 50분 동안 13, 300배 G에서 원심분리한다. 원심분리는 잔류 부피가 50 마이크로리터 이하이면 완료된다. 유동을 버리고 500 마이크로리터의 미리 냉각된 1X PBS를 첨가하여 잔류 상청액을 희석한다.
50 마이크로리터의 잔류 상청액이 남아있을 때까지 동일한 조건을 사용하여 샘플을 다시 원심분리한다. 상청액의 100X 희석액을 얻기 위해, 500 마이크로리터의 미리 냉각된 1X PBS를 첨가하고, 원심분리 과정을 반복한다. 글리칸 분석 방법과의 호환성을 보장하기 위해 상청액을 40 마이크로리터의 리터 당 약 2.5 그램의 최종 농도로 농축하십시오.
글리칸 분석을 위해, 200 마이크로리터의 자성 비드 용액을 2밀리리터 PCR 튜브로 옮긴다. 마그네틱 스탠드 위에 올려 놓고 상층액에서 비드를 분리하고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 자석 스탠드에서 튜브를 제거하고 정제 된 단백질 샘플 및 볼텍스를 추가하십시오.
다음으로, 공급 변성 완충액을 샘플 튜브에 첨가하고, 섭씨 60도에서 8분 동안 인큐베이션한다. 최적의 반응 성능을 위해 시료 튜브를 열어 두십시오. 인큐베이션 후, PNGase F를 첨가하고, 정제된 항체로부터 글리칸을 절단하기 위해 섭씨 60도에서 또 다른 20분 동안 인큐베이션한다.
N- 글리 칸의 방출 후, 샘플 튜브와 소용돌이를 닫으십시오. 이어서, 샘플 튜브에 아세토니트릴을 첨가하고, 볼텍스하고, 실온에서 일분 동안 인큐베이션한다. 샘플 튜브를 자기 스탠드에 배치하여 용액으로부터 비드를 분리한다.
그런 다음, 피펫을 사용하여, 비드를 만지지 않고 조심스럽게 상청액을 제거한다. 형광단 함유 글리칸 표지 용액을 흄 후드에서 샘플에 첨가하고 볼텍싱하여 혼합한다. 뚜껑을 열어 섭씨 60도에서 20분간 인큐베이션한 후, 샘플을 아세토니트릴로 세 번 세척하여 과량의 염료를 제거하였다.
이어서, 표지된 글리칸을 이중 증류수에서 용출시킨다. 샘플 튜브를 자기 스탠드에 놓고 정제되고 표지된 글리칸으로 농축된 상청액을 수집한다. 그런 다음 필요한 모든 표준과 샘플을 준비하고 지정된 트레이 위치에로드하십시오.
글리칸 분석 프로토콜을 실행하고 적절한 소프트웨어를 사용하여 샘플에 존재하는 글리칸을 분석하고 식별합니다. 웨스턴 블롯 분석은 세 개의 Fut8 DsiRNA 구축물의 혼합물로 형질감염된 세포에서 감소된 Fut8 단백질 발현을 보여주었다. 녹다운 세포로부터의 글리칸 구조 또한 감소된 푸코실화를 나타냈다.
이러한 경향은 아갈락토실화 구조에서 가장 뚜렷하게 나타났으며, 갈락토실화 구조에서 더 적은 정도로 관찰되었다. 코어 푸코실화의 두 배 감소는 세포 생존력에 큰 차이 없이 단일 구형파 펄스와 비교하여 두 개의 구형파 펄스를 사용한 전기천공으로부터 관찰되었다. 전반적으로, 짧은 간섭 RNA 농도를 증가시키는 것은 수확 시간을 증가시키는 것보다 코어 fucosylation에 큰 간섭을 갖는다.
물과 아세토니트릴 사이의 비율은 글리칸이 용액 또는 비드의 일부에 있는지 여부를 결정합니다. 이는 용액에서 라벨이 붙은 글리칸을 우발적으로 제거하지 않도록 세척 단계에서 기억하는 것이 중요합니다. 후속 실험은 항체 의존성 세포 매개 세포독성 및 보체 의존성 세포독성을 정량화하기 위해 세포 기반 분석을 사용하여 정제된 모노클로날 항체의 특성화를 수반할 수 있다.
